动物实验和临床观察结果证实,各种药理学手段干预抑制心脏肥大和纤维化,可以延缓心脏功能的恶化。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽产物,通过与其血管紧张素II 1型受体（AT1R）的结合,对心血管系统的变化、起着重要的病理生理调节作用。尽管AngII转换酶抑制剂或受体阻断剂,已常规用于临床并取得了良好的治疗效果,但病人观察的结果表明,此类药物的使用可产生一系列的副作用。因此,寻求通过调节AngⅡ系统的变化,进而减少心脏重塑并促进心脏功能恢复的辅助疗法,仍值得进一步研究。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种肠降血糖激素,体内半衰期较短,使用外源性GLP-1协同剂利拉鲁肽已广泛用于糖尿病人的治疗。近年来的研究结果表明,不依赖降血糖调节机制的利拉鲁肽疗法,也可用于高血压,心肌梗塞,心肌病和其它多种心血管疾病的治疗。但有关GLP-1疗法对压力性负荷所致心力衰竭的疗效和作用机理,尚缺少足够的系统性评价和探索。因此,本研究选择了大鼠腹主动脉缩窄在体心脏模型,观察了利拉鲁肽对由压力负荷增加所致AngII系统活化的干预特征（研究第一部分）,包括:1)心肌氧化应激和抗氧化酶的作用;2)AngII AT1/AT2受体平衡的调节;3)纤维细胞的迁移和增生的影响;4)心肌细胞肥大和心脏收缩和舒张功能的调节。为了解调节的可能机制,实验进一步分析了利拉鲁肽疗效的作用环节（研究第二部分）,包括:1)观察血液中GLP-1水平的变化;2)心脏形态和重量的作用;3)纤维化反应调节蛋白表达如mTOR/p70S6K的影响;4)自噬调节蛋白表达如LC3,Beclin-1,p62的影响;5)心肌纤维化和心功能改变的调节。在培养的H9C2心肌细胞,观察了利拉鲁肽对AngⅡ诱导下心肌细胞反应特征的直接作用（研究第三部分）,包括:1)细胞增殖和肥大的作用;2)AngII受体表达的调节;细胞氧化反应水平如ROS和纤维化介导蛋白TGFβ1和α-SMA的调定;3)纤维化调节蛋白如mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响;4)胶原蛋白表达变化的作用。在上述研究中,为澄清利拉鲁肽调定AngII受体和纤维化的传导机制,实验采用AngII AT1受体阻断剂替米沙坦和mTOR特异性抑制剂雷帕霉素进行了对比性观察,证实了利拉鲁肽受体通路和氧化应激的直接细胞效应。本研究的结果表明,GLP-1疗法对压力负荷增加所致的心肌纤维化和功能紊乱,有显著的抑制作用;这种保护效应是通过调定AngII受体和纤维化反应过程来实现的。这些研究结果也为GLP-1疗法在心衰病人的治疗,提供了新的实验基础和应用前景。第一部分胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑并改善心脏功能目的:血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）通过引起心脏重塑和功能障碍而导致心力衰竭的发生,在心力衰竭的发病机制中具有重要的作用。已证明胰高血糖素样肽1（GLP-1）对动物和患者具有心脏保护作用。本研究想证实GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是否通过改变AngⅡ1型受体（AT1R）受体表达来抑制腹主动脉缩窄（AAC）引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）替米沙坦治疗组（Telmi组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以10mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠替米沙坦。2.定期测量大鼠体重和血糖值。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.酶标仪检测:通过丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）和人N端前脑钠素（NT-pro BNP）试剂盒检测大鼠心脏MDA和NT-pro BNP的含量以及SOD的活性。5.免疫组化法:定位及评估心脏组织的ACE2、巨噬细胞、肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。6.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。7.Western-blot法:测定心肌组织中AT1R、AT2R、TGF-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3、smad4、smad7、collagenI和collagenⅢ的蛋白定量表达。8.采用2D Vivid7超声仪测定大鼠的心功能。9.采用BL-410生物信号采集与处理系统:检测大鼠心率、血压及左心室血流动力学指标。结果:1.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响:从术后第2周开始定期测量大鼠体重和血糖值,随着时间的推移,虽然两种数据均出现上升趋势,但各组同一时间的数值之间并无显著的统计学差异。2.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW的比值的影响:腹主动脉缩窄术16周后,相对于Sham组大鼠HW/BW比值（3.38±0.17vs.2.46±0.05,p<0.05）和MSA（1512±99 vs.586±98μm²,p<0.05）明显升高,利拉鲁肽和替米沙坦可分别减少HW/BW比值（2.63±0.09和2.77±0.05vs.AAC组,所有p<0.05）和MSA降至766±61μm²或871±51μm²（与AAC组相比,p<0.05）。3.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭的影响:相对于Sham组,AAC组在实验16周后检测发现NT-pro BNP（48.4±8.6pg/ml）表达水平显着提高,给予利拉鲁肽和替米沙坦治疗后,NT-pro BNP的表达水平分别为（10.3±0.8pg/ml和14.8±1.3pg/ml vs.AAC组,所有p<0.05）。4.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响:与Sham组相比,AAC组心肌组织中的MDA表达显著提高（23.4±1.3vs.16.3±0.6nmol/mg,p<0.05）,SOD表达水平却降低（8.1±0.8 vs.10.4±0.4U/mg,p<0.05）。相对于AAC组,给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后可使MDA水平分别降低至15.9±1.6和17.2±1.4nmol/mg（相对于AAC组,p<0.05）,且SOD酶活性分别提高至11.9±1.2和11.6±1.1U/mg（与AAC组相比,p<0.05）,结果提示给药后心脏抗氧化能力增强。5.利拉鲁肽和替米沙坦降低术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2的影响:实验结束时,相对于Sham组,AT1R的蛋白表达水平显著提高10.55±2.5%,而AT2R的蛋白表达则降低了36.43±5.6%,p<0.05。在手术后给予利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AAC组呈现相反的表达水平。在抑制AT1R表达的同时刺激AT2R的表达,体现为AT1R/AT2R比例的降低。免疫组织化学染色显示,相对于Sham组,AAC组中血管周围和心肌间质中ACE2的表达显著减弱。相对于AAC组,在术后给予利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗可逆转ACE2的表达下降。6.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1的影响:免疫组织化学法检测AAC组心脏切片结果表明,在血管周围区域和心肌间质中聚集了大量巨噬细胞,而利拉鲁肽或替米沙坦治疗可减轻这些巨噬细胞的聚集数量,Sham组则很少见巨噬细胞在心肌组织间隙中聚集。与AAC组巨噬细胞浸润增强相一致,心肌中TGF-β1的表达也显著增加。WB检测TGF-β1的蛋白质水平,进一步证实了TGF-β1表达的变化。与AAC组相比,在腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦可使心脏中巨噬细胞浸润和TGF-β1的表达均降低。7.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白的影响相对于Sham组,AAC组在心肌血管周围出现大量的α-SMA阳性肌成肌纤维细胞。而在Sham组,在心肌细胞间隙中仅有很少的α-SMA阳性细胞表达。在进行腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦的药物治疗,α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显减少。在Sham组中,Smad2和Smad3几乎没有被磷酸化。然而AAC组,Smad2/3的磷酸化显著增强,与Smad2/3的总蛋白水平增加相一致。相对于Sham组,AAC组中Smad4的总蛋白水平显著上调,而Smad7的总蛋白表达下调。然而,通过利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗后明显逆转了所测Smad家族成员蛋白质表达的变化趋势。8.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响:与Sham组相比,AAC组中胶原蛋白I和Ⅲ的蛋白水平显著增加。利拉鲁肽或替米沙坦的给药组I型和Ⅲ型胶原蛋白的产生相对AAC组显著减少。AAC组Masson结果显示由胶原蛋白面积百分比来表示的沉积胶原蛋白区域在血管周围和间质心肌中显著扩展。在整个实验中,在假手术对照中均未检测到新合成的胶原蛋白。腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙药物组,心脏中血管周区域和心内膜均显示胶原沉积显著减少。9.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响:超声结果显示相对于Sham组,AAC组在实验的16周时导致LVIDd显著增加,LVEF和LVFS降低。与AAC组的结果相比,利拉鲁肽或替米沙坦治疗可增强心脏功能。BL-410生物信号采集和处理系统结果显示:相对于Sham组,AAC组中大鼠的MAP,HR和LVEDP各项指标都显着增加,LVSP降低。此外,左室压力的最大增加速率(+dp/dt_max)和左室压力的减小速率(-dp/dt_max)明显降低。利拉鲁肽和替米沙坦治疗16周可有效预防心脏功能减退,与抑制心脏肥大和纤维化的结果相一致。结论:1.利拉鲁肽对心肌重塑和心功能具有保护作用;2.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和ACE2的表达,进而减少自由基产生有关;3.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第二部分胰高血糖素样肽1通过抑制mTOR/p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用目的:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）介导组织纤维化并负面调节自噬。本部分旨在研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过抑制mTOR/p70S6K信号传导并促进自噬活性来保护心脏免受腹主动脉缩窄引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）雷帕霉素治疗组（Rapa组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以0.2mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠雷帕霉素。2.检测大鼠血糖和血浆中GLP-1含量,利用GLP-1试剂盒酶标仪检测。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织进行固定、包埋后,HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.免疫组化法:定位及评估心脏组织的肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。5.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。6.Western-blot法:测定心肌组织中GLP-1R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、LC3、Beclin-1、p62、collagen I和collagenⅢ的蛋白定量表达。7.无创评估大鼠心脏整体功能。8.有创大鼠血流动力学测定。结果:1.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠基本状态的影响各组血糖和体重均有增高趋势,但是在四个实验组之间没有发现统计学差异。2.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏形态和HW/BW比值的影响相对于Sham组,AAC组在实验结束后发现心脏重量显著增加,并引起结构性扩张,利拉鲁肽和雷帕霉素给予治疗后明显减轻。相对于Sham组,AAC组HW/BW比显著增加（4.07±0.22 vs.2.68±0.21,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗显著降低了HW/BW比（与AAC组相比,分别为2.98±0.20和2.85±0.18,所有p<0.05）。相对于Sham组,AAC组的MSA明显增加（553±23 vs.232±25μm2,p<0.05）。利拉鲁肽或雷帕霉素治疗可将MSA相对降低至294±24μm2或322±23μm2,与AAC组相比,所有p<0.05。3.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠血浆GLP-1水平和GLP-1受体表达的影响与Sham组相比,AAC组导致血浆GLP-1水平显著降低（0.10±0.01vs.0.15±0.01ng/ml,p<0.05）,GLP-1受体的表达下调了26.1±5.6%。相对于AAC组,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药使血浆GLP-1水平显著升高（相对于AAC组分别为0.15±0.01和0.14±0.01ng/ml,所有p<0.05）,在这些组中与GLP-1水平升高相一致,GLP-1受体的表达水平升高。4.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠肌成纤维细胞增殖的影响相对于Sham组,AAC组心肌间质含有丰富的α-SMA阳性肌成纤维细胞。然而与AAC组相比,利拉鲁肽或雷帕霉素的给药抑制了α-SMA阳性的肌成纤维细胞的出现数量。5.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响相对于Sham组,AAC组没有改变mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但是明显提高了其磷酸化水平。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用。6.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠LC3,Beclin-1和p62表达的影响相对于Sham组,腹主动脉缩窄后LC3-I稳定增加（p<0.05）,而自噬抑制的标志物LC3-Ⅱ/LC3-I比率降低。与Sham组相比,AAC组心肌Beclin-1的表达下降（p<0.05）。与Sham组的大鼠相比,AAC组p62的蛋白水平显著升高（p<0.05）。利拉鲁肽作用后逆转AAC组的LC3,Beclin-1和p62蛋白表达,和雷帕霉素的表达调节相一致。7.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠胶原合成和组织纤维化的影响相对于Sham组,AAC组胶原I和Ⅲ的蛋白质水平增加。Masson三色染色法结果显示,AAC组心肌中纤维化区域在心肌间质和血管周围区域明显增加。在整个实验中,在Sham组心肌间质和血管周围区域均未检测到新合成的胶原蛋白。用利拉鲁肽或雷帕霉素治疗等效地抑制了胶原的表达,并减少了心肌间质和血管周围区域的纤维化沉积。8.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏整体功能的影响相对于Sham组,AAC组LVSs,LVIDd,LVIDs,LVPWd明显增加,EF和FS降低,利拉鲁肽或雷帕霉素治疗增强心脏功能逆转了AAC组的心脏功能指标变化。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对术后大鼠心脏收缩和舒张功能的影响与Sham组相比,AAC组HR和MAP显著增加,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax分别降低了24±3%、32±2%和27±3%（p<0.05）,LVEDP增加了230±12%（p<0.05）。利拉鲁肽和雷帕霉素改变了AAC组代表心脏功能变化的趋势,从而保护心脏功能。结论:1.利拉鲁肽通过增加血浆GLP-1水平和GLP-1R表达对长期压力超负荷大鼠的心脏具有保护作用;2.利拉鲁肽对大鼠的心脏保护作用主要通过下调mTOR/p70S6K信号激活自噬,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第三部分胰高血糖素样肽1对血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用及机制研究目的:选用AngⅡ诱导H9C2心肌细胞为研究对象,观察利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2细胞肥大和纤维化的影响作用。以血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦作对照,进一步验证利拉鲁肽对心肌细胞肥大和纤维化的抑制作用是通过影响AT1R信号传导的激活而进行,以mTOR的特异抑制剂雷帕霉素和mTOR的特异兴奋剂MHY1485作对照,进一步验证利拉鲁肽可通过抑制mTOR/p70S6K通路抑制心肌细胞肥大和纤维化的形成。方法:1.AngⅡ诱导H9C2心肌细胞模型建立2.分组:第一部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）替米沙坦组（AngⅡ+Telmi）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的Telmi;第二部分:（1）空白对照组（Control）:加入等体积培养基;（2）模型对照组（AngⅡ）:含10-6mol/L AngⅡ的培养基;（3）利拉鲁肽组（AngⅡ+Lira）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-7mol/L的Lira;（4）雷帕霉素组（AngⅡ+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-6mol/L的Rapa;（5）MHY1485组（AngⅡ+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ和10-5mol/L的MHY1485;（6）AngⅡ+Lira+Rapa组（AngⅡ+Lira+Rapa）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-6mol/L的Rapa;（7）AngⅡ+Lira+MHY1485组（AngⅡ+Lira+MHY1485）:含10-6mol/L的AngⅡ,10-7mol/L的Lira和10-5mol/L的MHY1485。3.实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测H9C2心肌细胞中ANP和BNP的m RNA含量。4.鬼笔环肽染色心肌细胞面积。5.Western-blot法:测定心肌细胞中AT1R、AT2R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、TGF-β1、collagen I的蛋白定量表达。6.流式检测心肌细胞中ROS水平表达。7.细胞免疫荧光染色:定位及评估心肌细胞中TGF-β1、α-SMA、collagen I的表达。结果:1.AngⅡ诱导H9C2模型建立10-6 mol/L AngⅡ作用心肌细胞24h后,不论是增殖率还是细胞表面积都相对最大。因此根据实验结果选取10-6 mol/L AngⅡ作用24h用于后续实验。2.不同浓度利拉鲁肽对AngⅡ引起H9C2心肌细胞增殖的影响在降低AngⅡ引起的H9C2心肌细胞增殖率实验中选取10-7 mol/L liraglutide进行实验。3.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞肥大的影响利用鬼笔环肽对细胞进行染色测量细胞表面积。结果显示与Control组细胞表面积811.8±64.1μm2相比,AngⅡ组心肌细胞表面积为1191.8±69.1μm2,明显增大。而加入利拉鲁肽和替米沙坦后,面积分别减少到1007.8±62.3μm2和902.3±64.3μm2（所有数据,p<0.05）。心肌细胞ANP和BNP含量可反映心肌细胞的肥大程度,利拉鲁肽和替米沙坦均可降低AngⅡ引起心肌细胞的ANP和BNP的m RNA含量的增高。4.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞AT1R和AT2R蛋白表达的影响使用蛋白印迹法检测AngⅡ受体的表达程度。在AngⅡ组AT1R表达增高,AT2R降低,在AngⅡ给药的基础上分别加入利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AngⅡ组呈现相反的表达水平。5.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内ROS表达水平的影响镜下拍照结果显示与Control组细胞相比较,AngⅡ组的ROS荧光亮度明显增高,加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,ROS荧光亮度下降（见图3-8）。流式结果显示与镜下观察结果相一致,AngⅡ组心肌细胞的ROS免疫荧光值为5546±202,相对于control组3264±205明显增高（p<0.05）。加入利拉鲁肽和替米沙坦后,ROS荧光平均免疫荧光值降为4804±203和3781±218（见图3-9）。6.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内TGF-β1水平的影响AngⅡ组TGF-β1免疫荧光平均光密度（AOD）为0.08±0.007,明显高于Control组细胞TGF-β1的AOD为0.02±0.008。加入利拉鲁肽和替米沙坦的细胞组,TGF-β1的AOD为0.05±0.010和0.03±0.011。相对于AngⅡ组明显降低,具有统计学意义。通过蛋白质印迹测定法检测各组细胞水平的TGF-β1的蛋白水平,和荧光结果一致,进一步证实了TGF-β1表达的变化趋势。7.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内α-SMA水平的影响免疫荧光结果定位显示α-SMA在心肌细胞中的表达主要位于心肌细胞质中。进行平均光密度值结果统计,结果显示AngⅡ组心肌细胞中α-SMA的表达显著增加（AOD为0.11±0.01 vs.0.05±0.01 Control,p<0.05,见图3-10A）。在给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后心肌细胞中α-SMA的表达平均光密度值为0.08±0.01和0.06±0.01,与AngⅡ组相比均降低（见图3-10B）。8.利拉鲁肽和替米沙坦对心肌细胞内Collagen I表达水平的影响免疫荧光法检测细胞内胶原蛋白I主要表达在心肌细胞质中,在给予AngⅡ后collagen I的表达增多。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗有效地抑制了胶原I的平均光密度值,并减少了心肌细胞质中荧光亮度。使用蛋白质印迹法进一步确定了各组细胞胶原蛋白I的蛋白表达。和荧光结果相一致,如图3-12C典型条带及平均灰度值结果分析显示,AngⅡ组的胶原I的蛋白质水平表达增加,加入利拉鲁肽或替米沙坦治疗均有效地抑制了胶原I的蛋白表达水平。9.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞面积的影响鬼笔环肽染色心肌细胞表面积和前面的结果相一致。在此组实验中,在AngⅡ给药基础上加入雷帕霉素也明显减少了由于AngⅡ造成心肌细胞表面积增大,结果为884.2±84.5μm2,在AngⅡ给药基础上混合给予利拉鲁肽和雷帕霉素,进一步减少了雷帕霉素组的细胞表面积。相反在加入MHY1485（mTOR的特异兴奋剂）后,增加了AngⅡ造成的心肌肥大表面积为1318.0±80.1μm2。在加入利拉鲁肽和MHY1485药物后,逆转MHY1485增加AngⅡ造成的心肌肥大的程度。10.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞mTOR和p70S6K蛋白表达的影响相对于Control组,AngⅡ组没有改变mTOR的总蛋白水平,但是明显提高了磷酸化的mTOR的水平（Ser2448处的磷酸化）。另外,心肌细胞中p70S6K的总蛋白水平在AngⅡ刺激后没有改变,但是检测到了明显的磷酸化的p70S6K（在Thr389磷酸化）（p<0.05,图3-14B）。利拉鲁肽或雷帕霉素的给药并不影响mTOR和p70S6K的总蛋白水平,但在两种蛋白的磷酸化中均具有相一致性的抑制作用（p-mTOR和p-p70S6K）。利拉鲁肽或雷帕霉素混合给药后加强了这一现象的发生,但在AngⅡ基础上加入MHY1485再加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485的结果,降低mTOR和p70S6K的磷酸化水平（p<0.05,图3-14）。11.利拉鲁肽和雷帕霉素对心肌细胞内Collagen I水平的影响蛋白质印迹法确定了胶原蛋白I的表达,在AngⅡ组相对于Control组增加。免疫荧光结果显示,AngⅡ组中心肌细胞质中荧光亮度明显增加,在Control组心肌细胞质中collagen I表达较少。在AngⅡ给药的基础上加入利拉鲁肽或雷帕霉素治疗有效地抑制了collagen I的表达,并减少了心肌细胞质中荧光亮度,在MHY1485组加入利拉鲁肽后,可以逆转MHY1485组collagen I的表达水平。结论:1.利拉鲁肽通过降低AT1R,上调AT2R的表达,进而减少自由基,抑制心肌细胞肥大;2.利拉鲁肽通过抑制TGF-β1的表达,减少肌成纤维细胞的表达,进而减少心肌细胞纤维化的形成;3.利拉鲁肽通过抑制mTOR/p70S6K通路降低心肌细胞肥大和纤维化的形成。