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背景:百草枯(Paraquat,PQ)是临床上最普遍的中毒物质之一,临床急救病例中,因意外或故意摄入除草剂农药PQ造成的致死率大于90%。在任何暴露途径下PQ中毒都主要积聚于患者肺部,其导致的不可逆的和广泛的肺纤维化是造成患者死亡的主要原因。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与百草枯中毒所致的肺间质纤维化的过程。在此过程中,细胞上皮标志物如E-钙粘附蛋白(Epithelia cadherin,E-cadherin)的表达下调,而间质标记物如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),波形蛋白(Vimentin)等表达上升,细胞连接减弱或消失,细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM)蛋白沉积,并获得了迁徙侵袭能力等。目前对于百草枯中毒所致的肺间质纤维化尚无有效治疗手段,因此,寻找新的治疗靶点具有非常重要的意义。近年来,非编码RNA(Non-protein-coding RNA,ncRNA)对细胞病理生理功能的调控作用得到越来越多的关注。非编码RNA包括miRNA,LncRNA,siRNA,piRNA等。它们可以通过多种信号通路调节细胞进程,这些信号通路很多都参与炎症、EMT等的发生。竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络是指一些具有相同miRNA应答元件(miRNA response element,MRE)的RNA可以竞争性结合同一miRNA结合位点来降低miRNA对其他靶基因的抑制作用,进而影响生物学行为。有研究证明:基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)家族的成员MMP2在百草枯致肺纤维化时参与组织的异常重构。整合素α(Integrin alpha)的亚单位整合素α11(Integrin alpha 11,ITGA11)可参与肺纤维化的过程,miR-17-5p在特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的肺组织和成纤维细胞中低表达。ENCORI网站预测ITGA11可以作为ceRNA和MMP2竞争性结合miR-17-5p,该预测的ceRNA调控网络是否参与百草枯所致肺EMT,目前尚无文献报导。目的:揭示PQ中毒所致的肺EMT中的潜在ceRNA调控网络,为PQ中毒所致EMT提供潜在治疗靶点。研究方法:1、构建PQ中毒致肺上皮间质转化的体内模型,选用雄性C57/BL6小鼠,30mg/kg腹腔注射单次给药,用HE染色、Masson染色从组织病理水平观察小鼠是否发生肺纤维化,采用q RT-PCR的方法从基因水平检测实验组E-cadherin及α-SMA的相对表达情况,验证其EMT情况。2、采用q RT-PCR的方法从基因水平验证动物模型中ITGA11及MMP2的表达情况。3、初步摸索A549细胞PQ慢性中毒的适宜染毒暴露浓度,构建PQ中毒致肺上皮间质转化的细胞模型。提取细胞RNA及蛋白质,采用qRT-PCR和Western-blot的方法分别从基因水平和蛋白水平验证实验组E-cadherin、α-SMA及MMP2的相对表达情况;采用划痕实验和Transwell实验验证百草枯染毒组细胞迁移能力的改变;采用免疫荧光从蛋白水平进一步检测E-cadherin、α-SMA在模型中表达趋势的改变。4、在细胞模型中,采用qRT-PCR的方法从基因水平验证ITGA11、miR-17-5p的变化。5、采用特异性siRNA干扰ITGA11的表达,采用qRT-PCR的方法检测siRNA干扰序列下调ITGA11的效能,并检测下调ITGA11后MMP2的表达情况;采用westernblot检测PQ染毒后下调ITGA11对MMP2及上皮标志物E-cadherin的影响;以免疫荧光的方法进一步验证PQ染毒后下调ITGA11对MMP2表达的影响。6、转染miR-17-5p的类似物(mimic)或抑制剂(inhibitor)人为上调或下调miR-17-5p的表达,采用qRT-PCR从基因水平检验上调或下调miR-17-5p对ITGA11和MMP2表达的影响;采用免疫荧光进一步验证PQ染毒后miR-17-5p对ITGA11和MMP2表达的调控作用。7、进行双荧光素酶报告基因实验,构建ITGA11野生型(WT)及突变型(MUT)的pSI-CHECK2双荧光素酶载体,与miR-17-5p的mimic及mimic NC共转染后验证ITGA11是否为miR-17-5p的靶基因。结果:1、PQ染毒组小鼠肺组织的HE染色结果显示:PQ染毒后小鼠肺组织结构明显破坏,肺泡破裂融合,肺泡间隔增粗,Masson染色结果显示:与对照组相比,PQ染毒后肺组织中胶原蛋白沉积明显增多,即病理结果提示PQ处理后小鼠肺组织发生了明显的纤维化;qRT-PCR结果显示:PQ染毒组肺组织中E-cadherin表达下调(P<0.05),α-SMA表达上调(P<0.05),组织发生了EMT。2、qRT-PCR结果显示:PQ染毒组肺组织中ITGA11和MMP2的表达上调(P<0.05)。3、60μmol/L的PQ染毒组细胞存活率尚可,qRT-PCR结果显示:PQ染毒组细胞中E-cadherin的表达下调(P<0.05),而α-SMA和MMP2的表达上调(P<0.05);Western-blot结果显示:PQ染毒组细胞中E-cadherin的表达下调(P<0.05),而α-SMA和MMP2的表达上调(P<0.05);免疫荧光结果中E-cadherin和α-SMA的表达情况与Western-blot结果一致;划痕实验和Transwell实验表明PQ染毒组细胞的迁移能力增强(P<0.05)。4、PQ染毒组A549细胞中ITGA11的表达上调(P<0.05)、而miR-17-5p的表达下调(P<0.05)。5、qRT-PCR结果显示:转染siITGA11可明显下调ITGA11的表达(P<0.05),且下调ITGA11后MMP2的表达也下调(P<0.05);Western-blot结果显示:PQ染毒后,下调ITGA11后MMP2的表达也下调(P<0.05),且上皮表达标志物E-cadherin表达上调(P<0.05);免疫荧光结果显示:在无PQ处理的对照组和PQ染毒组,下调ITGA11后ITGA11和MMP2的荧光强度都减弱,且PQ染毒组的ITGA11和MMP2的荧光强度要强于无PQ处理的对照组。6、qRTPCR结果显示:转染miR-17-5p类似物可明显上调miR-17-5p的表达(P<0.05),且ITGA11及MMP2的表达同时下调(P<0.05),而加入miR-17-5p抑制剂后可下调miR-17-5p的表达(P<0.05),且ITGA11及MMP2的表达同时上调(P<0.05);免疫荧光结果显示:在无PQ染毒组和PQ染毒组,上调miR-17-5p可减弱ITGA11及MMP2的荧光强度,下调miR-17-5p可增强ITGA11及MMP2的荧光强度,且PQ染毒后ITGA11及MMP2的荧光强度增强。7、双荧光素酶报告基因实验结果提示:pSI-Check2‐ITGA11‐WT+mimic组的荧光素酶活性要低于pSI-Check2‐ITGA11‐WT+mimic NC组(P<0.05),而pSI-Check2‐ITGA11‐MUT+mimic组的荧光素酶活性与pSI-Check2‐ITGA11‐MUT+mimic NC组无差异(P>0.05),即ITGA11是miR-17-5p的靶基因。结论:ITGA11在PQ致肺EMT过程中作为ceRNA结合miR-17-5p,从而调控MMP2的表达。