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1研究背景和目的熊胆粉为中医临床常用的名贵药材之一,具有抗炎、抗病毒、杀菌、保肝利胆等作用。熊胆粉中的化学成分有胆汁酸、氨基酸、胆红素、蛋白质、微量元素等,其中胆汁酸成分是熊胆粉中的主要成分。由于熊胆粉产量有限,且熊胆粉的使用饱受国内外动物保护组织的长期抵制,因此,熊胆粉替代品的研究迫在眉睫。生物转化熊胆粉是由上海凯宝药业股份有限公司自主研发的新的中药材代用品,以鸡胆粉为原料,经生物转化技术而制得的熊胆粉类似物,其所含牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的含量可达到现行熊胆粉的部颁标准,但是对于生物转化熊胆粉替代熊胆粉的可行性仍需深入研究。此外,现行熊胆粉部颁标准存在薄层鉴别项的样品前处理操作步骤繁琐、含量测定项所采用的紫外（UV）检测器对胆汁酸成分灵敏度差、含量测定仅以牛磺熊去氧胆酸为指标成分进紫外行测定的问题,因此,应在熊胆粉质量标准提升的基础上,建立生物转化熊胆粉及其原料鸡胆粉的质量标准,以期更好地保障培育（生物转化）熊胆粉和熊胆粉的一致性。本课题将对熊胆粉、生物转化熊胆粉及其原料鸡胆粉的化学成分进行系统分析,并对鸡胆粉生物转化为生物转化熊胆粉的质量传递过程进行初步探讨,建立相应的质量标准,为生物转化熊胆粉替代熊胆粉提供试验依据。2研究方法与结果（1）生物转化熊胆粉与熊胆粉、鸡胆粉的化学成分系统比较本研究采用超高效液相-质谱联用（UPLC-MS）以及超高效液相-电喷雾式检测器（UPLC-CAD）和液体萃取表面分析-质谱联用（LESA-MS）新技术,对熊胆粉中胆汁酸分析方法进行比较。结果表明,建立的LESA-MS分析方法具有良好的重复性,可通过质荷比448.3和464.3快速区分熊胆粉及其伪品猪、牛、羊胆,通过质荷比514.3的相对丰度快速区分熊胆粉和鸡胆粉,但是无法实现胆汁酸同分异构体的鉴定。建立的UPLC-CAD特征图谱分析方法可区分胆汁酸同分异构体,共确定8个共有峰,分别为TUDCA、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺胆酸（TCA）、7-酮-牛磺石胆酸（7-keto-TLCA）、3-酮-牛磺熊去氧胆酸（3-keto-TUDCA）、胆酸（CA）、熊去氧胆酸（UDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）,可全面反映熊胆粉中的胆汁酸成分,但是相较UPLC-MS分析方法,缺乏质荷比信息。因此,本研究最终确定采用UPLC-MS作为胆汁酸定性定量的分析方法。本研究采用液质联用技术对生物转化熊胆粉、熊胆粉和鸡胆粉中的胆汁酸、氨基酸、脂类等成分进行定性定量分析,采用电感耦合等离子体质谱仪对微量元素和常量元素进行测定,参考药典方法对胆红素、蛋白质、水分、灰分等成分进行测定,在对三种胆粉中各化合物系统比较的同时,结合不同相似度评价方法对生物转化熊胆粉和熊胆粉的一致性进行评价,并对鸡胆粉生物转化为生物转化熊胆粉的质量传递过程进行分析。结果表明,生物转化熊胆粉、熊胆粉、鸡胆粉中均含有胆汁酸类、氨基酸类、脂类（脂肪酸、单酰甘油酯、磷脂等）、蛋白质、胆红素、微量元素和常量元素,其中胆汁酸类成分是主要成分,约占70%左右,非胆汁酸成分含量较低,约占20%～30%,其中氨基酸类约1%,脂类约1%～2%,胆红素约1%,蛋白质约10%,灰分约占7%～11%,总元素约1%,水分约3%～5%。经不同相似度评价结果可知,生物转化熊胆粉与熊胆粉的各可测成分的相似度介于0.87～0.98之间,胆汁酸成分的相似度介于0.90～0.99之间,均具有较高的相似性,此外,生物转化熊胆粉与鸡胆粉中的非胆汁酸成分具有较高的相似度,介于0.92～1.27之间,而胆汁酸类成分相似度低,介于0.42～0.65之间。结果表明,在生物转化过程中,鸡胆粉中胆汁酸成分可转化为生物转化熊胆粉中的胆汁酸成分,而非胆汁酸类成分基本维持不变,所得产物生物转化熊胆粉和熊胆粉相似度高,有望成为熊胆粉的可替代品。（2）生物转化熊胆粉与鸡胆粉的质量标准研究本研究采用反相薄层色谱法对生物转化熊胆粉建立定性鉴别方法,选择TUDCA、TCDCA、TCA、牛磺熊胆酸（TUCA）作为鉴别指标。所建立的反相薄层色谱方法操作简便,可实现生物转化熊胆粉的鉴别,同时可对其可能的伪品猪、牛、羊胆进行检查。采用高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）对生物转化熊胆粉的特征图谱进行研究,并对其胆汁酸类成分进行含量测定,选择主要活性成分TUDCA和TCDCA作为指标成分,并对生物转化熊胆粉和熊胆粉含量差异较大的TCA和TUCA进行限量控制。建立的HPLC-ELSD特征图谱可反映生物转化熊胆粉的主要胆汁酸成分,建立的HPLC-ELSD含量测定方法可实现生物转化熊胆粉中主要胆汁酸的含量测定,解决UV检测器对胆汁酸成分灵敏度差、重现性差等问题。本研究采用反相薄层色谱法对生物转化熊胆粉的原料药鸡胆粉建立定性鉴别方法,选择TCDCA、TCA作为鉴别指标。所建立的反相薄层色谱方法操作简便,可实现鸡胆粉的鉴别。采用HPLC-ELSD法对鸡胆粉的特征图谱进行研究,并对其胆汁酸类成分进行含量测定,选择生物转化所需的目标底物TCDCA作为指标成分,并对可能造成生物转化熊胆粉和熊胆粉差异的底物TCA进行限量控制。建立的HPLC-ELSD特征图谱可反映鸡胆粉的主要胆汁酸成分,建立的HPLC-ELSD含量测定方法可实现鸡胆粉中主要胆汁酸的含量测定,解决UV检测器对胆汁酸成分灵敏度差、重现性差等问题。3结论生物转化熊胆粉、熊胆粉和鸡胆粉中均含有胆汁酸类、氨基酸类、脂类（脂肪酸、单酰甘油酯、磷脂等）、蛋白质、胆红素、微量元素和常量元素,其中胆汁酸成分主要成分。鸡胆粉生物转化为生物转化熊胆粉的过程中,胆汁酸成分可转化为生物转化熊胆粉中的胆汁酸成分,同时基本维持非胆汁酸成分,所得产物生物转化熊胆粉和熊胆粉各化学成分组成及含量均具有较高的一致性,生物转化熊胆粉有望替代熊胆粉。本研究拟订的生物转化熊胆粉及其原料鸡胆粉的质量标准（草案）,可为生物转化熊胆粉和熊胆粉的疗效一致性提供保障。