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目的肺癌具有发病率高、死亡率高、进展速度快等特点,是对人类生命威胁最大的肿瘤性疾病之一。按照肺癌的病理形态及其临床特征,通常将其分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌6on-small-cell carcinoma, NSCLC)其中NSCLC约占75%～80%。 NSCLC患者就诊时大多数处于肿瘤进展期,已失去早期手术机会,故临床预后较差。WHO病理组织学分型通常将NSCLC分为鳞状细胞癌、腺癌和两者混合的腺鳞癌,其中腺癌又根据其形态学特点分为多种亚型。2015年WHO病理组织学分类借助P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA对于分化较差的非小细胞肺癌进行鳞癌亦或腺癌的判断,然而由于肺组织结构复杂,仍有一些组织形态鉴别诊断困难,造成针对组织学亚型NSCLC所制定的单一化疗方案被证实临床疗效不佳。随着分子生物学技术的不断发展,近年内发现NSCLC中约30%存在EGFR基因突变,特别是腺癌中有较高的突变率,针对具有EGFR基因突变的患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂可明显改善其预后。但究竟为何部分鳞癌会具有EGFR表达?以及哪型腺癌具有EGFR的高表达率尚不得而知。本研究通过免疫组化双染的方法,结合WHO的组织形态特点,建立了一种NSCLC的组织表型分类。在此基础上,使用一代测序技术检测各组织表型EGFR基因突变情况,探讨EGFR基因在不同组织起源NSCLC中的突变率及其相关性,为NSCLC的靶向治疗奠定相应的理论根据。方法收集NSCLC患者石蜡标本106例,首先根据2015年WHO肺癌的病理组织学和遗传学分类标准进行分型,再采用TTF-1/CK7和P63/NapsinA两种组合分别进行免疫组化双染,检测NSCLC标本中NapsinA, P63, CK7和TTF-1的表达情况,分析其与NSCLC各临床病理参数之间的关系,建立其组织表型分类。应用SANGERDNA测序技术,检测NSCLC标本中EGFR基因突变情况,分析EGFR基因在不同表型NSCLC中的突变率及其与临床病理各参数的关系。应用SAS 9.4统计软件进行卡方检验,以p≤0.05为差异有统计学意义。结果一、 P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA在正常肺组织的定位及其表达CK7、 NapsinA P日性染色呈红色,位于细胞浆；P63、 TTF-1阳性染色呈棕黄色／棕褐色,位于细胞核。P63表达于所有支气管呼吸上皮的基底细胞,而肺泡上皮细胞不表达；CK7表达于所有支气管呼吸上皮细胞(假复层柱状纤毛上皮)、支气管粘膜下的分泌腺上皮细胞以及肺泡上皮细胞；TTF-1主要表达于终末小支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞。NapsinA公表达于肺泡上皮细胞。使用P40与P63的免疫组化对比研究发现,其表达在大支气管和终末细支气管的呼吸上皮细胞中基本一致。CK5&6均不表达。二、P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA在不同类型NSCLC中的表达P63阳性表达在鳞癌、贴壁状腺癌、腺泡状腺癌和实体状腺癌中的阳性表达率分别为100%、47.37%、55.56%、80%,差异有统计学意义(p≤0.05)。CK7阳性表达在腺鳞癌、贴壁状腺癌、腺泡状腺癌和实体状腺癌中的阳性表达率分别为46.94%、100%、73.08%、100%,差异有统计学意义(p≤0.05). TTF-1阳性表达在贴壁状腺癌、腺泡状腺癌和实体状腺癌中的阳性表达率分别为4.08%、89.47%、88.89%、70.00%,差异有统计学意义(p≤0.05)。NapsinA阳性表达在贴壁状腺癌、腺泡状腺癌和实体状腺癌中的阳性表达率分别为14.29%、78.95%、92.59%和60%,差异有统计学意义(p≤0.05)。另有2例NSCLC病例,形态为腺癌图像,免疫组化仅CK7阳性,TTF-1, P63及NapsinA均为阴性。根据正常组织的免疫组化表达,我们认为其来源于呼吸道的分泌腺上皮。P63表达于所有鳞状细胞癌中,而CK5&6仅表达于高分化鳞状细胞癌。使用P40与P63的免疫组化对比研究发现,其表达在鳞状细胞癌中基本一致。三、P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA与NSCLC l|备床病理参数的相关性P63、 TTF-1和NapsinA在NSCLC中的表达与性别相关(p≤0.05),P63主要在男性表达,因为鳞状细胞癌多发生于男性吸烟者；TTF-1与NapsinA主要在女性表达,因为TTF-1主要表达于终末小支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞发生的腺癌,而NapsinA主要在肺泡小叶单位和肺泡发生的腺癌表达,故女性多见。CK7在NSCLC中的表达与性别无关(p>0.05)。P63和TTF-1在NSCLC中的表达与吸烟相关(p≤0.05)。 P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA在NSCLC中的表达与肿瘤分化程度无关(p>0.05)。 P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA在NSCLC中的表达与年龄、肿瘤大小及有无淋巴结转移无关(p>0.05)。四、不同表型NSCLC与临床病理参数的相关性呼吸道上皮癌、细支气管肺泡癌及肺泡上皮癌与性别、吸烟、肿瘤分化程度及肿瘤大小密切相关(p≤0.05),呼吸道上皮癌主要在男性吸烟者多发,且肿瘤生长较大。而肺泡上皮癌多发于非吸烟的女性,常呈中度分化。而肺泡上皮癌、呼吸道上皮癌及细支气管肺泡癌与年龄、有无淋巴结转移无关(p>0.05)。五、不同表型NSCLC与EGFR基因突变相关性EGFR基因在呼吸道上皮癌、细支气管肺泡癌及肺泡上皮癌中的突变率分别为27.12%、54.55%、60.00%,p≤0.05,差异有统计学意义。六、EGFR基因突变与NSCLC临床病理参数的相关性EGFR基因突变与吸烟密切相关,而与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小及有无淋巴结转移无关(p>0.05)。结论一、鉴于P63、 CK7、 TTF-1和NapsinA在正常肺组织和不同类型NSCLC中的表达情况,结合肺癌的组织学表现,我们将NSCLC分为以下几种组织表型,即呼吸道上皮癌、细支气管肺泡癌、肺泡上皮癌及分泌腺癌。呼吸道上皮癌组织学上可表现为单纯的鳞状细胞癌(CK5&6和／或P63阳性,CK7、 TTF-1, NapsinA阴性)、或单纯的腺癌(CK7/P63±TTF-1阳性,CK5&6和NapsinA阴性),或鳞腺混合型癌(CK5&6和／或P63阳性,CK7±TTF-1阳性,NapsinA阴性)。细支气管肺泡癌多表现为实体状腺癌、腺泡状腺癌和乳头状腺癌(CK7/TTF-1/NapsinA阳性,P63散在阳性)。肺泡上皮癌多表现为贴壁状腺癌、腺泡状腺癌和实体状腺癌(CK7/TTF-1/NapsinA阳性,P63阴性)。分泌腺癌组织形态类同于涎腺癌,免疫组化仅表达CK7, P63/TTF-1/NapsinA均阴性。P63表达于所有鳞状细胞癌中,而CK5&6仅表达于高分化鳞状细胞癌。使用P40与P63的免疫组化对比研究发现,其表达在大支气管和终末细支气管的呼吸上皮细胞中及鳞状细胞癌中基本一致。二、呼吸道上皮癌、细支气管肺泡癌及肺泡上皮癌与年龄、有无淋巴结转移无关,但与性别、吸烟、肿瘤分化程度及肿瘤大小密切相关三、NapsinA在NSCLC中的表达与患者性别密切相关,P63和TTF-1在NSCLC中的表达与患者性别及吸烟密切相关且TTF-1的表达与肿瘤分化程度相关,其联合应用有利于NSCLC的诊断及预后分析。四、EGFR基因在呼吸道上皮癌、细支气管肺泡癌及肺泡上皮癌中的突变率具有差异,EGFR基因突变更易发生于肺泡上皮癌。五、EGFR基因突变与吸烟密切相关,而与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小及有无淋巴结转移无关(p>0.05)。