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第一部分IgG4相关疾病血浆外泌体蛋白表达差异研究
背景和目的
IgG4相关疾病(IgG4-related disease，IgG4-RD)是近年来新认识的慢性炎性及纤维化疾病，表现为受累器官或组织肿瘤样肿胀、硬化，受累组织中大量淋巴浆细胞，尤其是IgG4阳性浆细胞浸润，常伴有血清IgG4水平升高(＞1350mg/L)。IgG4-RD为多器官受累的疾病，目前发病机制尚不清楚，以B细胞和浆母细胞异常为代表的体液免疫紊乱是IgG4-RD的主要特征，但诱导B细胞向分泌IgG4的浆母细胞转化的机制尚不明确。外泌体(exosome)是细胞分泌的一种胞外囊泡，直径为30至100纳米，存在于许多体液中，外泌体通过与免疫细胞细胞相互接触的方式促进其产生炎性细胞因子，从而增强自身免疫反应，在多种免疫细胞活化及功能发挥中起到重要作用。外泌体中成分，主要是蛋白在疾病发生中起到重要作用。因此，我们旨在研究IgG4-RD患者血浆外泌体中的蛋白表达差异，探索这些差异在IgG4-RD发生和发展中的作用。
材料和方法
本实验纳入IgG4-RD初治患者62例，性别、年龄匹配健康对照(HC)47例。入组IgG4-RD患者符合2011年IgG4-RD国际诊断标准。采集患者及健康对照外周血10ml，首先分离获取血浆并冻存于-80℃冰箱。分别用超速离心法和外泌体试剂盒提取法获取IgG4-RD患者及HC血浆外泌体。获取外泌体进行质谱检测。通过exocarta外泌体数据库匹配，GO富集分析及wikipathway可视化分析，同时对差异蛋白进行STRING蛋白互作网络分析，分析这些差异表达蛋白可能的生物学功能。筛选差异表达蛋白进行外泌体ELISA及WB验证。
结果
1、通过生物信息学分析，共检测获得329种血浆外泌体蛋白。定义蛋白水平＞1.2倍或＜0.83倍的蛋白为差异表达蛋白。由此筛选出176种差异蛋白，其中包括82种上调表达蛋白及96种下调表达蛋白。
2、GO注释分析发现在外泌体富集的显著性差异表达蛋白主要与补体系统和免疫反应相关。通过疾病相关性分析，发现目的蛋白富集在免疫缺陷病中的可信度排在第三位。进行wikipathway分析发现，补体级联通路和补体激活通路中C1复合物，C3和C5表达下调，而补体C1抑制蛋白酶(SERPING1)和C3补体抑制酶(CFI)显著上调。揭示外泌体中补体蛋白可能与IgG4-RD存在一定关联。
3、ELISA检测外泌体中蛋白表达情况，结果发现IgG4-RD患者外泌体中C3较HC下调(70.97±28.93μg/mlvs113.49±37.51μg/ml，P＜0.0001)，IgG4-RD患者外泌体C5a也较HC下降(6.14±6.46ng/mlvs9.41±8.17ng/ml，P=0.02)，与质谱结果相符。而C1q表达在HC和IgG4-RD外泌体中无显著统计学差异(119.37±55.11μg/mlvs105.28±36.95μg/ml，P=0.242)。
4、通过相关分析，IgG4-RD患者外泌体中C3下调表达与ESR、血清IgG、IgG1及IgG4呈负相关，相关系数r分别为r=-0.465，r=-0.450，r=-0.416及r=-0.391;P值分别为P=0.01，P=0.02，P=0.03，P=0.04。IgG4-RD患者外泌体中C5a下调表达与IgG1和IgG4-RD疾病活动度呈负相关，r分别为r=-0.524及r=-0.405;户值分别为P=0.006和P=0.04。
5、WB验检测外泌体中补体C3、C5及SERPING1的表达，发现与ELISA和质谱结果相符。IgG4-RD患者外泌体C3表达较HC低(57.53±19.89vs84.41±35.95)，P=0.02。外泌体C5表达在HC外泌体(142.96±43.13)表达较IgG4-RD(114.15±36.06)升高，P=0.03。而SERPING1在IgG4-RD外泌体较HC升高(199.47±37.05vs159.64±51.65)，P=0.04。
结论
与HC相比，IgG4-RD患者外泌体中82种蛋白表达上调，96种蛋白表达下调。差异表达蛋白主要富集于外泌体，补体功能和体内免疫反应中。外泌体中补体蛋白可能与IgG4-RD发病有一定关联。IgG4-RD外泌体补体C3、C5表达下调可能提示病情活动。
关键词:IgG4相关疾病;外泌体;质谱分析;补体
第二部分IgG4-RD外泌体参与B细胞、T细胞分化及组织损伤
背景和目的
通过前期研究，我们发现IgG4-RD外泌体中补体活化，补体成分表达下降，上述改变与血清免疫球蛋白水平及病情活动具有相关性。IgG4-RD受累组织浸润大量T细胞及B细胞，尤其是Th2细胞及浆母细胞参与组织损伤。IgG4-RD血清补体水平下降可提示病情活动。本研究拟进一步探究IgG4-RD的外泌体是否影响B和T细胞功能、参与组织损伤及其在IgG4-RD发病中的可能作用。
实验材料和方法
入组58例初治IgG4-RD患者及73例HC。经过外泌体体外刺激实验后，应用流式细胞术检测IgG4-RD外泌体对B细胞及T细胞活化、增殖、凋亡和分化的影响;应用qPRC技术检测B细胞抗体类别转化基因变化;并对外泌体刺激后的B、T细胞进行蛋白质组学研究。在受累组织方面，进行蛋白组学研究，应用质谱方法检测患者颌下腺组织中外泌体表达情况，同时与非特异性唾液腺炎的腺体组织进行比较。
结果
1、与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体对B细胞活化、增殖和凋亡无明显影响。
2、与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体可促进CD19±IgD±CD38±/-na(i)veB细胞下降(63.23％±6.89％vs57.75％±7.09％)，P=0.01;CD19±IgD-CD27±memoryB细胞表达升高(7.52％±2.98％vs10.48％±3.15％)，P=0.007。此外，CD19±IgD-CD38hi浆细胞在IgG4-RD外泌体刺激情况下较HC外泌体刺激也升高(4.07％±1.92％vs2.47％±1.34％)，P=0.006。
3、原代B细胞在IgG4-RD外泌体刺激后，XBP1基因表达较HC外泌体刺激升高(2.388±1.332vs1.023±0.249)，P=0.049。RamosB细胞AICDA基因表达在IgG4-RD外泌体刺激较HC外泌体升高(1.415±0.234vs1.014±0.185)，P=0.01。
4、蛋白质组分析表明，与正常人群血浆外泌体比较，经IgG4-RD患者血浆外泌体刺激的B细胞中共有98个差异蛋白，其中60个上调蛋白，38个下调蛋白。
5、Cytoscape软件分析B细胞差异表达蛋白之间的相互关系，56个差异表达蛋白成功匹配到STRING数据库。我们发现IgG4-RD患者外泌体差异蛋白互作网络中，蛋白CYCS位于中央节点位置，在IgG4-RD患者外泌体中显著上调，并参与多组蛋白相互作用。进行pathway通路分析，发现氧化损伤通路蛋白CYCS显著上调，同时补体下调。揭示IgG4-RD外泌体刺激B细胞后可能激活了B细胞自身氧化损伤通路。
6、IgG4-RD患者B细胞及其亚群ROS水平检测，IgG4-RD患者CD19±B细胞ROS水平较健康对照升高(10.94％±7.57％vs23.85％±13.94％)，P=0.001;CD19±B细胞ROSMFI也较HC明显升高(2720±1223vs1873±764)，P=0.04。进一步探究发现，CD19±CD24-CD38hi浆母细胞/浆细胞ROS表达在IgG4-RD患者(59.17％±23.73％)也较HC明显升高(30.68％±20.15％)，P=0.003;IgG4-RD患者CD19±CD24-CD38hi浆母细胞/浆细胞ROSiMFI表达也较HC明显升高[336(174-1416)vs124(22-174)]，P=0.004。此外，IgG4-RD患者CD19±CD24intCD38intna(i)veB细胞ROS表达较HC升高(17.52％±13.35％vs8.44％±4.50％)，P=0.02。IgG4-RD患者memoryB细胞进行ROS染色，提示IgG4-RD患者CD19±CD24hiCD38-memoryB细胞ROS表达与HC相比也呈现升高(22.21％±19.85％vs10.44±5.72％),P=0.01。
7、CD4±IL-4±Th2型细胞在IgG4-RD外泌体刺激下较HC外泌体高(9.29％±3.68％vs7.34％±2.70％)，P=0.0497。与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体对T细胞活化、增殖和凋亡无明显影响。
8、与慢性非特异性颌下腺炎患者比较，IgG4-RD受累颌下腺筛选555个差异蛋白，其中346个上调蛋白，209个下调蛋白。进行GO分析提示:差异蛋白主要参与溶酶体，外泌体，细胞浆等生物学过程。通路富集发现B细胞受体信号通路中多个蛋白LCK，SYK，HCLS1，LYN，GRB2，BTK，VAV1，PTPN6，PLCG2显著上调，揭示IgG4-RD颌下腺组织的变化可能与B细胞作用受体活动相关。外泌体是否参与调控组织B细胞异常仍需进一步研究。
结论
我们研究提示，IgG4-RD外泌体可参与IgG4-RDB细胞抗体类别转化，激活了B细胞自身氧化损伤通路进而参与IgG4-RD发病;IgG4-RD外泌体也可诱导na(i)veT向Th2细胞分化增多。IgG4-RD颌下腺蛋白组研究提示外泌体可能参与组织损伤。
背景和目的
IgG4相关疾病(IgG4-related disease，IgG4-RD)是近年来新认识的慢性炎性及纤维化疾病，表现为受累器官或组织肿瘤样肿胀、硬化，受累组织中大量淋巴浆细胞，尤其是IgG4阳性浆细胞浸润，常伴有血清IgG4水平升高(＞1350mg/L)。IgG4-RD为多器官受累的疾病，目前发病机制尚不清楚，以B细胞和浆母细胞异常为代表的体液免疫紊乱是IgG4-RD的主要特征，但诱导B细胞向分泌IgG4的浆母细胞转化的机制尚不明确。外泌体(exosome)是细胞分泌的一种胞外囊泡，直径为30至100纳米，存在于许多体液中，外泌体通过与免疫细胞细胞相互接触的方式促进其产生炎性细胞因子，从而增强自身免疫反应，在多种免疫细胞活化及功能发挥中起到重要作用。外泌体中成分，主要是蛋白在疾病发生中起到重要作用。因此，我们旨在研究IgG4-RD患者血浆外泌体中的蛋白表达差异，探索这些差异在IgG4-RD发生和发展中的作用。
材料和方法
本实验纳入IgG4-RD初治患者62例，性别、年龄匹配健康对照(HC)47例。入组IgG4-RD患者符合2011年IgG4-RD国际诊断标准。采集患者及健康对照外周血10ml，首先分离获取血浆并冻存于-80℃冰箱。分别用超速离心法和外泌体试剂盒提取法获取IgG4-RD患者及HC血浆外泌体。获取外泌体进行质谱检测。通过exocarta外泌体数据库匹配，GO富集分析及wikipathway可视化分析，同时对差异蛋白进行STRING蛋白互作网络分析，分析这些差异表达蛋白可能的生物学功能。筛选差异表达蛋白进行外泌体ELISA及WB验证。
结果
1、通过生物信息学分析，共检测获得329种血浆外泌体蛋白。定义蛋白水平＞1.2倍或＜0.83倍的蛋白为差异表达蛋白。由此筛选出176种差异蛋白，其中包括82种上调表达蛋白及96种下调表达蛋白。
2、GO注释分析发现在外泌体富集的显著性差异表达蛋白主要与补体系统和免疫反应相关。通过疾病相关性分析，发现目的蛋白富集在免疫缺陷病中的可信度排在第三位。进行wikipathway分析发现，补体级联通路和补体激活通路中C1复合物，C3和C5表达下调，而补体C1抑制蛋白酶(SERPING1)和C3补体抑制酶(CFI)显著上调。揭示外泌体中补体蛋白可能与IgG4-RD存在一定关联。
3、ELISA检测外泌体中蛋白表达情况，结果发现IgG4-RD患者外泌体中C3较HC下调(70.97±28.93μg/mlvs113.49±37.51μg/ml，P＜0.0001)，IgG4-RD患者外泌体C5a也较HC下降(6.14±6.46ng/mlvs9.41±8.17ng/ml，P=0.02)，与质谱结果相符。而C1q表达在HC和IgG4-RD外泌体中无显著统计学差异(119.37±55.11μg/mlvs105.28±36.95μg/ml，P=0.242)。
4、通过相关分析，IgG4-RD患者外泌体中C3下调表达与ESR、血清IgG、IgG1及IgG4呈负相关，相关系数r分别为r=-0.465，r=-0.450，r=-0.416及r=-0.391;P值分别为P=0.01，P=0.02，P=0.03，P=0.04。IgG4-RD患者外泌体中C5a下调表达与IgG1和IgG4-RD疾病活动度呈负相关，r分别为r=-0.524及r=-0.405;户值分别为P=0.006和P=0.04。
5、WB验检测外泌体中补体C3、C5及SERPING1的表达，发现与ELISA和质谱结果相符。IgG4-RD患者外泌体C3表达较HC低(57.53±19.89vs84.41±35.95)，P=0.02。外泌体C5表达在HC外泌体(142.96±43.13)表达较IgG4-RD(114.15±36.06)升高，P=0.03。而SERPING1在IgG4-RD外泌体较HC升高(199.47±37.05vs159.64±51.65)，P=0.04。
结论
与HC相比，IgG4-RD患者外泌体中82种蛋白表达上调，96种蛋白表达下调。差异表达蛋白主要富集于外泌体，补体功能和体内免疫反应中。外泌体中补体蛋白可能与IgG4-RD发病有一定关联。IgG4-RD外泌体补体C3、C5表达下调可能提示病情活动。
关键词:IgG4相关疾病;外泌体;质谱分析;补体
第二部分IgG4-RD外泌体参与B细胞、T细胞分化及组织损伤
背景和目的
通过前期研究，我们发现IgG4-RD外泌体中补体活化，补体成分表达下降，上述改变与血清免疫球蛋白水平及病情活动具有相关性。IgG4-RD受累组织浸润大量T细胞及B细胞，尤其是Th2细胞及浆母细胞参与组织损伤。IgG4-RD血清补体水平下降可提示病情活动。本研究拟进一步探究IgG4-RD的外泌体是否影响B和T细胞功能、参与组织损伤及其在IgG4-RD发病中的可能作用。
实验材料和方法
入组58例初治IgG4-RD患者及73例HC。经过外泌体体外刺激实验后，应用流式细胞术检测IgG4-RD外泌体对B细胞及T细胞活化、增殖、凋亡和分化的影响;应用qPRC技术检测B细胞抗体类别转化基因变化;并对外泌体刺激后的B、T细胞进行蛋白质组学研究。在受累组织方面，进行蛋白组学研究，应用质谱方法检测患者颌下腺组织中外泌体表达情况，同时与非特异性唾液腺炎的腺体组织进行比较。
结果
1、与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体对B细胞活化、增殖和凋亡无明显影响。
2、与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体可促进CD19±IgD±CD38±/-na(i)veB细胞下降(63.23％±6.89％vs57.75％±7.09％)，P=0.01;CD19±IgD-CD27±memoryB细胞表达升高(7.52％±2.98％vs10.48％±3.15％)，P=0.007。此外，CD19±IgD-CD38hi浆细胞在IgG4-RD外泌体刺激情况下较HC外泌体刺激也升高(4.07％±1.92％vs2.47％±1.34％)，P=0.006。
3、原代B细胞在IgG4-RD外泌体刺激后，XBP1基因表达较HC外泌体刺激升高(2.388±1.332vs1.023±0.249)，P=0.049。RamosB细胞AICDA基因表达在IgG4-RD外泌体刺激较HC外泌体升高(1.415±0.234vs1.014±0.185)，P=0.01。
4、蛋白质组分析表明，与正常人群血浆外泌体比较，经IgG4-RD患者血浆外泌体刺激的B细胞中共有98个差异蛋白，其中60个上调蛋白，38个下调蛋白。
5、Cytoscape软件分析B细胞差异表达蛋白之间的相互关系，56个差异表达蛋白成功匹配到STRING数据库。我们发现IgG4-RD患者外泌体差异蛋白互作网络中，蛋白CYCS位于中央节点位置，在IgG4-RD患者外泌体中显著上调，并参与多组蛋白相互作用。进行pathway通路分析，发现氧化损伤通路蛋白CYCS显著上调，同时补体下调。揭示IgG4-RD外泌体刺激B细胞后可能激活了B细胞自身氧化损伤通路。
6、IgG4-RD患者B细胞及其亚群ROS水平检测，IgG4-RD患者CD19±B细胞ROS水平较健康对照升高(10.94％±7.57％vs23.85％±13.94％)，P=0.001;CD19±B细胞ROSMFI也较HC明显升高(2720±1223vs1873±764)，P=0.04。进一步探究发现，CD19±CD24-CD38hi浆母细胞/浆细胞ROS表达在IgG4-RD患者(59.17％±23.73％)也较HC明显升高(30.68％±20.15％)，P=0.003;IgG4-RD患者CD19±CD24-CD38hi浆母细胞/浆细胞ROSiMFI表达也较HC明显升高[336(174-1416)vs124(22-174)]，P=0.004。此外，IgG4-RD患者CD19±CD24intCD38intna(i)veB细胞ROS表达较HC升高(17.52％±13.35％vs8.44％±4.50％)，P=0.02。IgG4-RD患者memoryB细胞进行ROS染色，提示IgG4-RD患者CD19±CD24hiCD38-memoryB细胞ROS表达与HC相比也呈现升高(22.21％±19.85％vs10.44±5.72％),P=0.01。
7、CD4±IL-4±Th2型细胞在IgG4-RD外泌体刺激下较HC外泌体高(9.29％±3.68％vs7.34％±2.70％)，P=0.0497。与HC外泌体相比，IgG4-RD外泌体对T细胞活化、增殖和凋亡无明显影响。
8、与慢性非特异性颌下腺炎患者比较，IgG4-RD受累颌下腺筛选555个差异蛋白，其中346个上调蛋白，209个下调蛋白。进行GO分析提示:差异蛋白主要参与溶酶体，外泌体，细胞浆等生物学过程。通路富集发现B细胞受体信号通路中多个蛋白LCK，SYK，HCLS1，LYN，GRB2，BTK，VAV1，PTPN6，PLCG2显著上调，揭示IgG4-RD颌下腺组织的变化可能与B细胞作用受体活动相关。外泌体是否参与调控组织B细胞异常仍需进一步研究。
结论
我们研究提示，IgG4-RD外泌体可参与IgG4-RDB细胞抗体类别转化，激活了B细胞自身氧化损伤通路进而参与IgG4-RD发病;IgG4-RD外泌体也可诱导na(i)veT向Th2细胞分化增多。IgG4-RD颌下腺蛋白组研究提示外泌体可能参与组织损伤。