弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是一类起源、基因表达谱和预后均具有高度异质性的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）,发病率约占NHL的1/3。目前,R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松）方案仍是各类DLBCL亚型的标准治疗方案。尽管接受R-CHOP方案治疗的DLBCL患者5年总体生存率达到60-70%,仍有30-40%的患者进展为复发/难治性DLBCL。嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗已被批准用于复发或难治性DLBCL,30-40%的DLBCL患者能够获得持久缓解,但该疗法产生的神经毒性和细胞因子释放综合征等严重的副作用,仍然是一个亟待解决的难题。还有一些FAD已批准的或实验性的靶向治疗药物可能适用于特定的DLBCL亚群。例如,ibrutinib在活化B细胞型DLBCL（ABC-DLBCL）的有效率能达到37%。Lenalidomide在ABC-DLBCL亚群患者中也表现出了明显的疗效。因此,随着淋巴瘤发病机制研究不断深入,越来越多的小分子靶向治疗药物逐步涌现,对改善DLBCL患者的预后具有重要意义。Fer是一类非受体酪氨酸激酶,在几乎所有细胞中低表达。FerT是Fer的截短变异体,仅在肿瘤细胞和生精细胞中表达。Fer/FerT激酶构成了线粒体电子传递复合体-1,参与调节ATP的生成,在肿瘤细胞中十分活跃。多项研究表明,Fer在肺癌、肝癌、前列腺癌以及乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达增高并在肿瘤进展中发挥调控作用。在患者的肿瘤组织样本中检测发现,Fer表达水平增高与患者的不良预后具有显著相关性。在细胞功能学方面,下调Fer的表达抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡减轻化疗耐药。另外,Fer可能还参与了囊泡运输和线粒体重编程的过程。根据已有的研究报道,Fer可以与E-钙黏蛋白（E-cadherin）结合调控细胞粘附,也可以被几种生长因子受体激活,例如表皮生长因子受体（EGFR）,血小板衍生生长因子（PDGF）和胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）。另外,Fer的下游与 STAT3、CTTN、Rac-GTPase 调节剂以及 MAPK、PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-catenin、Notch途径相互作用。另外,Fer可以被KIT或FLT3激活促进AML细胞存活[16,23,24]。但是,Fer在DLBCL中的表达及其与DLBCL进展的关系目前尚不明确。外泌体是一种直径为30-150nm的细胞外囊泡,起源于细胞内吞过程中形成的内吞体,然后经由细胞的胞吐作用释放到细胞外。外泌体通过介导细胞间通讯广泛参与了细胞的生理和病理过程,例如细胞分化、细胞迁移、免疫应答、抗原呈递、血管新生等。越来越多的证据表明,外泌体可能在血液系统恶性肿瘤的发生发展过程中扮演基因信使的重要作用,例如骨髓微环境重编程,促进细胞耐药,抑制免疫反应等。此外,外泌体自身结构和功能,使它具有了稳定性、免疫逃逸、无毒性等优势,因而显示出了潜在的临床应用价值。一方面,外泌体在各种生物体液中含量丰富,许多研究认为可以将其作为疾病的诊断标志物,另一方面,外泌体可以被用作药物递送载体,提高药物靶向结合的效率。另外,外泌体作为细胞间信息交换的信使还可以作为疾病治疗的靶标。本部分研究旨在观察Fer在DLBCL中的表达水平及其与DLBCL患者临床特征的关系,进一步探讨Fer在DLBCL进展中的作用。近来研究报道,Fer抑制剂E260可选择性的激活肝癌细胞的能量消耗过程,导致癌细胞发生坏死和细胞自噬。在本研究中我们拟进一步探讨E260是否在DLBCL进展中发挥抗肿瘤活性及其发挥作用的机制。另外,Fer在DLBCL患者淋巴瘤组织中表达增高,但是Fer能否在DLBCL患者血浆外泌体中表达并发挥标志物的作用目前尚不清楚。因此,本研究拟通过检测DLBCL患者血浆外泌体Fer的表达水平,探讨Fer的表达水平与疾病发生发展的关系。使用Oncomine和TCGA数据库检索发现Fer mRNA在DLBCL中表达上调。Kaplan-Meier生存曲线显示在DLBCL患者中,Fer高表达与较短的总生存期（OS）相关。免疫组化检测发现,与正常组织相比,Fer在DLBCL患者淋巴瘤组织中表达增高,并且Fer阳性表达与较高的Ann Arbor分期、LDH、Ki67、β2-M、IPI评分和较短的OS（中位数=7.28,p<0.05）具有明显相关性。此外,Cox回归分析显示,Fer表达增高可能作为DLBCL的独立危险因素（p<0.05）。qRT-PCR和Western blot检测显示,Fer在DLBCL细胞系中表达增高（p<0.05）。在功能学方面,敲减Fer表达后能显着降低OCI-LY3和U2932细胞株的增殖能力,而过表达Fer促进了细胞的增殖（p<0.05）。我们进一步通过体内实验证实了 Fer对DLBCL生长的调控作用。与上述结果一致,敲减Fer表达后抑制了小鼠皮下肿瘤的生长。并且,对小鼠肿瘤组织进行免疫组化检测显示,组织中Ki67的表达降低。进而,通过使用Annexin V/7AAD双染流式检测细胞凋亡发现,与对照相比,敲减表达Fer促进了 OCI-LY3细胞（8.8%vs 1.6%）和U2932细胞（7.1%vs 3.3%）的凋亡（p<0.001）。通过Transwell分析发现,敲减Fer表达显着削弱了 OCI-LY3和U2932细胞的侵袭能力（p<0.01）,而过表达Fer后提高了 OCI-LY3和U2932细胞的侵袭能力（p<0.05）。另外,与单药相比,sh-Fer 联合 doxorubicin 或 ibrutinib 处理 OCI-LY3 和 U2932 细胞,显著抑制了 DLBCL细胞的增殖（p<0.05）。在治疗方面,E260和EXO-E260在抑制OCI-LY3和U2932细胞增殖中显示出了明显的剂量依赖性和时间依赖性（p<0.05）。在U2932细胞系中,EXO-E260在48小时后显示出比E260更强的抗增殖作用（p<0.05）。通过Annexin V/7AAD双染流式检测细胞凋亡发现,在E260和EXO-E260处理的细胞中,指示晚期细胞凋亡/坏死的Annexin V/7AAD染色明显增加（p<0.01）。进一步通过Western blot分析发现,经过E260处理后的DLBCL细胞并不表达凋亡标记物cleaved-caspase3和cleaved-PARP,因此我们认为E260引起的是细胞坏死而非细胞凋亡。通过Transwell检测E260对DLCBL细胞的侵袭能力的影响发现,E260和EXO-E260明显削弱了 OCI-LY3和U2932细胞的侵袭能力（p<0.01）。总而言之,E260治疗可抑制DLBCL的进展,然而使用外泌体携带E260（EXO-E260）可以达到更好的抗肿瘤效果（p<0.01）。使用E260联合doxorubicin或ibrutinib共处理DLBCL细胞,结果显示,与单一药物组相比,EXO-E260与doxorubicin或ibrutinib的联合应用显着降低了细胞增殖（p<0.05）。这一结果提示,EXO-E260能增强细胞对化疗药的敏感性。在体内实验中,给予人来源的OCI-LY3细胞移植瘤小鼠腹腔注射PBS,E260（25mg/kg）和100μg EXO-E260来验证EXO-E260在体内的抗肿瘤能力。与用PBS或E260处理的肿瘤相比,EXO-E260显着抑制小鼠皮下OCI-LY3移植瘤的生长（p<0.01）。免疫组化染色结果显示,在EXO-E260处理的小鼠中Fer和Ki67的表达也降低了。以上结果证明,E260在体内、外均能发挥抑制肿瘤增殖的作用。在机制研究中,我们首先使用STRING数据库预测了 Fer的相互作用蛋白,进一步对互作蛋白进行GO和KEGG富集分析,结果显示,Fer参与的生物学过程主要与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞粘附和药物反应有关。KEGG通路富集分析表明,Fer 与 Hippo、JAK-STAT、FoxO、PI3K-AKT 和 mTOR 信号通路显著相关。我们进一步在DLBCL细胞株中检测了与Hippo通路有关的相互作用蛋白（AJUBA,YWHAB,CDH1,CTNNB1）的表达,结果显示只有AJUBA表达增加。敲减Fer表达后能抑制AJUBA的表达。进一步通过Co-IP分析证明了 AJUBA和Fer之间的相互作用。通过Western blot分析证明E260下调了AJUBA表达,并增强了 DLBCL细胞中MOB1和YAPSer397的磷酸化水平。另外,E260可以降低核内YAP的表达水平引发YAP的胞质滞留。回复实验发现,在E260处理的细胞中过表达AJUBA后逆转了 p-YAP表达以及细胞增殖抑制和侵袭抑制。提取DLBCL异种移植小鼠血浆外泌体并通过qRT-PCR检测了 Fer mRNA的表达。我们发现,移植瘤小鼠的血浆外体Fer mRNA表达升高（p<0.05）,并与肿瘤体积呈正相关（r=0.65,p<0.05）。提取DLBCL患者血浆外泌体,检测Fer表达发现,与正常人相比,DLBCL患者血浆外泌体中Fer的表达水平增高（p<0.001）。经R-CHOP治疗后DLBCL患者血浆外泌体Fer的表达水平降低（p<0.05）。此外,DLBCL患者血浆中的外泌体AJUBA也表达上调（p<0.001）并与外泌体Fer的表达水平呈正相关（r=0.76,p<0.0001）。ROC曲线表明,外泌体Fer可以作为DLBCL潜在的诊断指标用以区分DLBCL患者和健康人,而且以外泌体Fer联合LDH的诊断效能最高（AUC=0.93,p<0.01）。此外,我们分析了 Fer与DLBCL患者临床病理特征的关系,发现外泌体Fer高表达与Ann Arbor分期、LDH、Ki67和IPI评分呈正相关（p<0.05）。在本研究中,我们发现在DLBCL患者中可观察到Fer高表达并与患者的不良预后相关。在功能学方面,敲减Fer的表达可显著抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,抑制细胞侵袭,提高DLBCL细胞对化疗药物的敏感性,而过表达则表现相反。在治疗方面,E260是Fer的靶向抑制剂,可以显著地抑制细胞的增殖和侵袭能力,增强DLBCL细胞的化疗敏感性。此外,在治疗中应用外泌体作为E260载体,明显增强了 E260的抗肿瘤作用。在机制方面,E260通过抑制AJUBA表达激活了 Hippo通路的活性,导致YAP发生胞内滞留。最后,我们检测了 DLBCL患者血浆外泌体Fer的表达,结果表明外泌体Fer可能作为DLBCL诊断和进展的潜在指标。综上所述,本研究证明了 Fer可以作为DLBCL发生发展的潜在指标以及治疗靶点。EXO-E260在DLBCL中表现出显著的抗肿瘤作用,这可能作为传统化疗的补充为DLBCL的治疗提供新的思路,并为外泌体在临床治疗中的应用开辟了新的途径。弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的成人侵袭性淋巴瘤的亚型,约占新发的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）的30-40%。DLBCL具有高度异质性,给DLBCL的准确诊断和治疗带来很大的困难。随着利妥昔单抗联合化疗的R-CHOP方案（利妥昔单抗,环磷酰胺,阿霉素,长春新碱,泼尼松）在临床上的应用,DLBCL患者的五年生存率由传统化疗的32%提高至68%。虽然,利妥昔单抗大大改善了患者预后,但是也仅有50%的患者对利妥昔单抗反映良好,而且长期使用利妥昔单抗导致的CD20表达降低是利妥昔单抗耐药的重要原因。约有40%的患者进展到复发或难治阶段,此类患者的5年生存率仅为20%。所以,探索DLBCL发生的原因和进展的分子机制,开发DLBCL新的预测标志物和潜在的治疗靶点,对于改善DLBCL患者的预后至关重要。MicroRNAs（miRNAs）是一系列小的、单链的、高度保守的非编码RNA,长度为18-22个核苷酸。miRNAs通过与靶mRNA的3’-UTR结合,在转录后水平抑制下游基因表达,导致翻译抑制或降解增加。证据表明,miRNAs可能参与调节肿瘤的发生发展和药物反应。此外,miRNAs也被认为可以用于疾病的诊断、进展和预后评估,目前已有数百种miRNA被确定为癌症的生物标志物。值得注意的是,已有报道与淋巴瘤相关的miRNA也可以在血液循环被中检测到。这可能是由于miRNA通过与RNA结合蛋白和/或被封装在细胞外囊泡内而免于被降解。越来越多的研究报道,循环外泌体miRNAs在多种肿瘤中可作为诊断和预后生物标志物。但是,外泌体miRNAs作为DLBCL诊断和预后评估的生物标志物的报道尚不多见。通过对GEO数据库分析获得与DLBCL进展相关的差异性miRNAs,检测差异性miRNAs在血浆外泌体中的表达,探讨miRNAs表达水平与DLBCL发生发展的关系,并进一步研究miRNAs在DLBCL进展中发挥的作用,为DLBCL的诊治提供新的思路和实验依据。为了获得参与DLBCL发生发展的差异miRNAs（differentially expressed miRNAs,DEMs）,我们从GEO数据库下载了两个标准化的微阵列数据集（GES117063和GSE29493）。两个数据集的重叠部分包含14个miRNAs。我们选择了11个下调的miRNAs（let-7c、miR-107、miR-133a、miR-142-3p、miR-210、miR-215、miR-30A-5p、miR-346、miR-375、miR-485-3p、miR-95）进行下一步研究。利用miRWalk 3.0和miRDB数据库对上述miRNAs的靶基因进行预测。通过构建miRNA-mRNA的相互作用网络发现,大部分靶基因与miR-107和miR-30a-5p相关联。通过GEPIA数据库验证了靶基因的表达,其中NSL1、NFIB、MBNL3、AGO4、KMT2A在DLBCL中上调。利用DAVID在线工具对484个靶基因进行GO和KEGG富集分析。在生物过程中,这些靶基因主要富集在转录、转录调控聚合酶Ⅱ启动子和信号转导功能上。在细胞成分中,靶基因主要富集于细胞核、核质和纺锤体。在分子功能中,靶基因主要富集于参与蛋白结合、ATP结合和锌离子结合等功能。在KEGG通路中,靶基因主要富集于MAPK信号通路、癌症转录调控失调相关信号通路和cAMP信号通路。接下来,我们收集了 42例DLBCL患者和31名健康志愿者的外周血,通过qRT-PCR检测DLBCL患者血浆外泌体DEMs的表达,发现miR-107和miR-375-3p表达下降,而miR-485-3p表达升高（p<0.01）。ROC曲线分析外泌体miRNAs在DLBCL患者中的诊断价值发现,血浆外泌体miR-107、miR-375-3p和miR-485-3p可以作为区分DLBCL患者与健康人群的潜在指标。miR-107、miR-375-3p、miR-485-3p 的曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为 0.854、0.769、0.739,最佳cutoff值分别为0.67、0.64、0.60。外泌体miR-107的低表达与DLBCL患者较高的Ann Arbor分期、ECOG评分、LDH、β2-MG和IPI评分显著相关（p<0.05）。综上所述,血浆外泌体miR-107的低表达可能是DLBCL疾病进展的一个指标,我们认为miR-107可能参与了 DLBCL的发生和发展。为了验证miR-107在DLBCL进展中的作用,我们首先检测了 miR-107在DLBCL细胞系中的表达,然后进行了gain-and loss-of-function功能分析。MiR-107 在 DLBCL（OCI-LY1,OCI-LY3,OCI-LY8 和 OCI-LY10）细胞系中的表达低于正常对照组（p<0.01）。CCK-8检测细胞增殖显示,与Agomir NC组相比,过表达miR-107显著抑制了 OCI-LY3细胞的增殖能力（p<0.01）。而下调miR-107的表达,OCI-LY8细胞细胞增殖能力显著增强（p<0.01）。Annexin V/7AAD流式细胞学检测细胞凋亡显示,过表达miR-107促进DLBCL细胞凋亡,而敲减miR-107表达抑制DLBCL细胞凋亡（p<0.01）。最后,通过Transwell实验评估miR-107对DLBCL细胞侵袭的影响。结果显示,过表达miR-107明显削弱了 OCI-LY3细胞的侵袭能力,而敲减miR-107可显著刺激OCI-LY8细胞的侵袭能力（p<0.01）。为了进一步证实miR-107小鼠体内的抗肿瘤作用,我们建立了人细胞来源的异种移植瘤小鼠模型。观察发现,接种了高表达miR-107细胞株的小鼠其肿瘤生长速度明显小于对照组（图41）。总的来说,miR-107在DLBCL进展中发挥了抑癌因子的作用,即抑制细胞增殖、侵袭和促进细胞凋亡。为了探索miR-107调控DLBCL进展的机制,我们首先使用了 4个数据库对miR-107的靶基因进行了预测,得到了 28个靶基因。然后,我们使用DAVID生物信息学工具对靶基因进行了功能富集分析和和通路富集分析。结果显示,miR-107 与调控细胞增殖、细胞周期、血管生成、PI3K-AKT 信号通路、卵母细胞减数分裂相关信号通路、AMPK信号通路和Hippo信号通路密切相关。miRNACancerMap数据库显示,miR-107参与调控细胞凋亡、细胞周期和PI3K-AKT信号通路。通过构建28个靶基因及其代表性通路的生物分子网络发现,miR-107可能通过靶向YWHAH参与PI3K-AKT、卵母细胞减数分裂和Hippo信号通路的调控。使用Cytoscape绘制lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络,进一步使用GEO数据库中的GSE97336数据集验证了差异表达的lncRNA发现,lncRNACKMT2-AS1和lncRNAZNF767P在DLBCL中表达上调,这将为进一步的研究lncRNA-miRNA-mRNA在DLBCL进展中的作用机制奠定了基础。为了筛选出miR-107下游的靶基因,我们首先从GEPAI数据库中检索了这28个靶基因在 DLBCL 中的表达情况,发现只有 14-3-3η、CDK6、RRAGC、PP2R5C、OGT、KIF23等6个基因在DLBCL中表达上调（p<0.05）。接下来,我们通过qRT-PCR检测了这些候选基因在DLBCL细胞株中的表达,结果发现,14-3-3 η在OCI-LY3和OCI-LY8细胞株中表达升高（p<0.05）。14-3-3η在过表达miR-107的细胞中表达下降,而在敲减miR-107的细胞中表达升高（p<0.05）。为了探讨14-3-3η在DLBCL患者中的表达,我们进行了 qRT-PCR和共聚焦检测。与健康对照相比,14-3-3η在DLBCL患者外周血单个核细胞中表达上调。同样,免疫荧光染色检测14-3-3η在DLBCL患者淋巴瘤组织切片中的表达发现,与对照组相比,14-3-3η在DLBCL患者淋巴瘤组织中表达升高,14-3-3η主要在细胞质中表达。总之,14-3-3η在DLBCL中表达上调,并受到miR-107的负性调节。进一步,我们使用荧光素酶报告基因检测了 miR-107和14-3-3η之间是否发生直接结合。通过向miR-107过表达的DLBCL细胞中转染荧光素酶报告基因质粒检测显示,转染了 WT型质粒的细胞荧光素酶活性显著下降,而转染了 MUT型质粒的细胞荧光素酶活性不受抑制。结果表明,miR107与14-3-3η的3’-UTR区存在特异性结合。本研究从GEO中检测到11个下调的miRNAs,在DLBCL患者血浆中观察到外泌体 miR-107、miR-375-3p 降低,miR-485-3p 升高（p<0.05）,通过ROC曲线分析血浆外泌体miRNAs在DLBCL患者中的诊断价值发现AUC分别为0.854、0.769和0.739。值得注意的是,DLBCL细胞中miR-107表达上调与DLBCL患者的晚期Ann Arbor期、IPI评分、高LDH和β2-MG具有显著相关性（all p<0.05）。表明miR-107可能在DLBCL的进展中发挥作用。通过转染miR-107 Agomir,上调miR-107可抑制DLBCL细胞增殖、诱导凋亡和细胞侵袭。同样,转染miR-107Agomir可以显著抑制OCI-LY8移植瘤小鼠的肿瘤生长。相反,miR-107拮抗剂下调miR-107可导致细胞增殖、凋亡抵抗和细胞侵袭。因此,我们猜测miR-107在DLBCL的进展中作为肿瘤抑制因子,抑制细胞增殖、侵袭和促进了细胞凋亡。此外,我们发现14-3-3η（YWHAH）在DLBCL中表达上调,并可被miR-107负性调节。因此,我们认为miR-107可能通过靶向14-3-3 η调控了 DLBCL的进展。本研究不仅揭示了外泌体miRNA作为潜在生物指标的可行性,而且为DLBCL的治疗提供了新的靶点。