毛冠鹿大脑组织cDNA文库构建及神经递质转运蛋白基因的克隆与分析

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运用SMART技术构建了毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)大脑组织全长cDNA文库。提取大脑组织总RNA,Oligotex mRNA Klit纯化、获得poly(A)<+>RNA,以CDS Ⅲ/3PcR引物进行逆转录,LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切及柱层析分离后,500 bp以上的片段与载体λTripIEx2连接,体外包装得到cDNA文库。经鉴定原始文库滴度为5.1 x10<5>pfu/ml,扩增后文库滴度为1.5×10<9>pfu/ml,重组率达到85%以上,插入片断平均长度约为1.0 kb,说明构建文库质量符合要求,可用于大脑特异表达基因的筛选。从该文库中克隆到了rig(rat insulinoma gene)基因全长(522bp),包含5’和3’非编码区,从第43至477个核苷酸为一完整阅读框(ORF),此阅读框可编码一个145氨基酸的rig蛋白。 为获得性连锁基因,在毛冠鹿睾丸组织cDNA文库中进行EST序列测定,共测得82个序列,其中27个为3’端序列,55+N5’端序列,将获得的cDNA序列用序列分析软件BLAsT与GellBank数据库中己知基因进行同源性比较,得到4个新基因,8个基因有重复,将序列在牛或人染色体上定位,发现其中3个基因定位在X染色体上提取毛冠鹿高分子量基因组DNA,HindⅢ酶切毛冠鹿基因组DNA,将酶切后的基因组DNA转移至尼龙膜。从毛冠鹿睾丸组织cDNA文库中克隆到神经递质转运蛋白(Neurotrallsmitter transporter)基因,用PCR法地高辛(DIG)标记DNA探针,用标记的探针进行Soulthem杂交。结果显示,经HindⅢ酶切杂交后雌雄结果无差异,都产生了2条杂交带。以毛冠鹿脑、肌肉、心脏、肺、睾丸、肾、肝和脾的总RNA为模板,合成cDNA第一链,用毛冠鹿神经递质转运蛋白基因特异引物RT-PCR分析不同组织mRNA表达状况。以毛冠鹿β2-微球蛋白基因的RT-PCR扩增产物作为阳性对照。结果表明神经递质转运蛋白基因仅在睾丸组织中表达,而其他组织不表达。
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