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壳聚糖(Chitosan,Ch)作为自然界中唯一的天然阳离子多糖,对DNA有很好的结合和保护作用,对生物体无毒、相容性好、可修饰性,本身具有一定的抑制微生物和抗癌作用,而且具有资源丰富、又可再生、生物降解等特点。作为一种新型的纳米微粒载体,具有广阔的应用前景。端粒酶(telomerase)是一种特殊的核糖核酸蛋白质聚合物,是依赖于RNA的DNA聚合酶:它能以自身作为模板,在DNA 3′端合成端粒重复序列,以弥补复制造成的端粒缩短,使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。端粒酶的催化亚单位端粒酶逆转录酶(hTERT)是其最主要成分,它能催化全酶活性,其启动子仅在肿瘤细胞中激活,因此可以作为肿瘤基因治疗的靶点来靶向治疗肝癌。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)是目前最为常用的自杀基因之一,已被广泛地应用于肿瘤的基因治疗中。目的:构建半乳糖化壳聚糖(GC)-pGL3-人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子-胸甘激酶(TK),即GC-pGL3-hTERTp-TK复合物,通过壳聚糖转染方法将其转染入肿瘤细胞后,观察壳聚糖载体的可行性及GC-pGL3-hTERTp-TK对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的影响。方法:1.细胞培养;2.通过酶切产物的连接,构建荧光报告质粒组和治疗质粒组;3.制备半乳糖修饰的壳聚糖,通过壳聚糖转染法转入人肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02;4.用荧光显微镜,液闪计数仪观察荧光报告质粒转染细胞后的荧光,以及hTERT启动子在细胞中驱动荧光基因表达的强弱;5.用caspase-3方法及流式细胞仪技术观察治疗质粒转染细胞后对细胞生长及凋亡的影响。结果:1.成功构建荧光报告质粒组:pGL3-basic(阴性对照)、pGL3-control(阳性对照)、pGL3-hTERT-Luc+;治疗质粒组:pGL3-basic-TK(阴性对照)、pGL3-control-TK(阳性对照)、pGL3-hTERTp-TK。2.使用Luciferase Assay检测系统发现,Ch-pGL3-hTERTp-Luc+转染HepG2细胞后的相对活性是Ch-pGL3-control的52%,但明显高于阴性对照Ch-pGL3-basic;但是Ch-pGL3-hTERTp-Luc+转染端粒酶阴性的L02细胞后其荧光活性仅为Ch-pGL3-control的10%,说明在肝癌细胞中hTERT启动子有强大的转录活性;相比之下,Ch-pGL3-hTERTp-Luc+质粒在端粒酶阴性的正常肝细胞L02中荧光素酶的表达很弱。而GC-pGL3-hTERTp-Luc+转染HepG2细胞后相对活性是Ch-pGL3-control的136%。3.在肝癌细胞中TK基因可以被hTERT启动子驱动高效的表达,几乎不影响正常肝细胞L02的生长;GC通过识别ASGPR受体结合到HepG2细胞表面,其携带的TK基因更易进入肝癌细胞,同时增强自杀基因TK的表达效果,肝癌细胞总的凋亡率达65.28%,而正常肝细胞则仅为10.80%。结论:壳聚糖可以作为一个很有潜力的基因载体。GC-pGL3-hTERTp-TK可以靶向攻击肝癌细胞,对正常肝细胞几乎无影响,GC-pGL3-hTERTp-TK基因传递系统具备靶向治疗肝癌的潜力。