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研究目的:本实验研究对象为分别来自于类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维细胞(fibroblast like synoviocytes,FLS)和正常人群的滑膜成纤维细胞(HFLS),从中分离到外泌体(Exosomes),通过测序方法对RA-FLS及HFLS外泌体的mi RNAs表达谱进行分析,得到差异性表达的mi RNA并验证,得到新的mi RNA。预测新mi RNA的靶基因则使用GO(基因本体论,Gene Ontology)富集分析方法,预测其可能的信号途径使用KEGG(京都基因与百科基因全书,Kyoto gene Encyclopedia)信号通路富集分析方法,以阐明RA-FLS及HFLS来源的外泌体中mi RNAs表达差异,为RA疾病诊断及疾病预后研究提供可能的新策略。方法:(一)RA-FLS及HFLS外泌体的分离及鉴定:实验对象为RA-FLS及HFLS各3组,经过细胞复苏、传代培养后,用超速离心法获取滑膜细胞的外泌体。用醋酸双氧铀/醋酸铅染色后在透射电镜观察所得其形态学特征;粒径大小使用粒径分析仪动态来计算,浓度通过酶标仪测定,Western blot法鉴定其特异性表面标志物(CD63、CD81、CD9)。(二)RA-FLS及HFLS外泌体mi RNA的测序分析比较:用试剂盒法提取总的small RNA,通过酶标仪检验其浓度及质量;对检验合格的mi RNA进行文库构建,在Illumina Hi Seq-4000平台下测序。对所得的原始数据(raw reads)进行长度分布及拷贝数统计,然后与mi RNA基因库进行对比、过滤获得clean reads,并对数据库里对比到的mi RNA进行注释和分析,未对比上的mi RNA即预测的新mi RNA;对新mi RNA通过DESeq算法对其进行差异性表达分析,应用生物信息分析筛选出差异性表达的mi RNA,实时逆转录PCR技术检测筛选出的mi RNA表达水平。(三)差异性表达的mi RNA的生物信息学分析:对表达存在差异的新mi RNA进行生物学分析,其可能靶基因通过GO富集分析方法预测,其发挥作用的信号途径采取KEGG信号通路富集分析来预测。结果:(一)成功提取到滑膜细胞外泌体:RA-FLS及HFLS的外泌体经过超速离心法获得,在透射电镜下可以观察样本呈现一侧凹陷的半球形或者呈茶托型的双层囊膜结构,NTA粒径分析其直径在30-150nm之间,通过Western Blot法检测到所提取的样本表达CD81、CD63、CD9。(二)滑膜细胞外泌体的mi RNAs测序:所提取的mi RNA浓度及质量合格。Illumina Hi Seq-4000测序所得到的原始数据raw reads,对其进行对比、过滤后得到clean reads,且其长度分布峰值在21-25nt左右;与不同数据库比对并注释出已知的mi RNA,碱基偏好性统计分析显示序列首位碱基偏向于碱基U,2-4号位缺少U,第7、10号位偏向于A等;长度15-25nt之间。而未对比上的mi RNA即为新的mi RNA。(三)滑膜细胞外泌体mi RNA差异性表达分析及验证:新的mi RNA在DESeq计算后分析,结果表明存在显著差异表达的一共有128个mi RNA,发生显著上调的有59个mi RNA,其余的69个mi RNA发生了显著的下调。生物信息分析RAFLS外泌体中表达丰度较高的5个mi RNAs(mi R-100-5p、mi R-34a-5p、mi R-199a-3p、mi R-29a-3p、hsa-let-7b-5p)并用RT-q PCR验证,结果示上述mi RNA的表达水平与测序结果一致,证明测序结果可信。(四)差异性表达的mi RNA的功能分析:GO富集分析的结果表明差异表达的mi RNA可能参与特定物质的结合过程,如激酶和蛋白激酶、蛋白结合;细胞组分分析的结果显示,差异表达的mi RNA与细胞质、细胞膜、高尔基体和细胞器的组成密切相关;对于生物学过程方面,这些差异表达的mi RNA参与调节转录、转录及DNA模版、蛋白磷酸化、生物过程的正调控以及神经系统发育等过程。KEGG富集分析结果显示差异表达的mi RNA参与的相关信号途径可能为内吞作用、钙信号通路、胰岛素信号途径、Erb B信号通路、神经营养素信号通路和肾上腺素能信号等等。结论:(一)成功分离并鉴定了RA-FLS及HFLS细胞上清液中存在外泌体,并且RA-FLS及HFLS外泌体中mi RNAs表达谱存在差异表达。(二)RA-FLS来源的外泌体中mi RNA可能参与RA的调控,这与外泌体的生物学功能相关。(三)本实验通过研究RA-FLS及HFLS的外泌体mi RNAs的差异性表达,并进一步分析其可能的靶基因及信号通路,为进一步研究RA诊断、疾病监测及预测预后、干预治疗提供了新的策略。