慢病毒介导的PLCE1基因沉默对食管癌细胞Eca109裸鼠移植瘤生长影响及机制的研究

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目的:探讨PLCE1(Phospholipase C Epsilon-1)基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体对食管癌Eca109细胞系裸鼠移植瘤生长的影响及机制。方法:前期研究已明确了具有下调PLCE1基因的si RNA干扰序列,设计并合成sh RNA oligo,将其构建入干扰慢病毒载体p SIH1-H1-cop GFP,用构建的慢病毒载体p SIH1-H1-cop GFP/sh R-PLCE1转染293T细胞来包装慢病毒,用包装的p L/sh RNA/PLCE1慢病毒转染Eca109细胞,观察转染效率。用实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)、蛋白印迹技术(Western Blot)分别检测慢病毒转染后Eca109细胞株中PLCE1 mRNA及蛋白水平表达的变化,明确处理后PLCE1沉默的效果。将处于对数生长期的食管癌Eca109细胞常规消化,将20只裸鼠随机分成实验组、阴性对照组,分别向裸鼠其右腋皮下分别注射p SIH1-H1-cop GFP/sh R-PLCE1或p SIH1-H1-cop GFP的食管癌Eca109细胞200微升(3×107个细胞),从肉眼可见肿瘤形成时开始,每三天测量一次各组肿瘤体积的大小及裸鼠体重,绘制肿瘤生长曲线,35天后处死裸鼠,取瘤测量体积和重量,分别计算体积抑瘤率和重量抑瘤率。免疫组化法检测PLCE1、Ki-67、Bcl-2蛋白在两组裸鼠移植瘤中的表达变化;免疫荧光法检测两组裸鼠移植瘤中PLCE1、Ki-67、Bcl-2和Beclin-1蛋白的表达;原位末端标记(TUNEL)染色法检测实验组和阴性对照组裸鼠移植瘤中的细胞凋亡变化情况。结果:1.qRT-PCR及Western bolt检测结果表明:PLCE1沉默组与阴性对照组相比,PLCE1的mRNA及蛋白表达水平明显下降,干扰效率为(73.00±7.95)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.绘制裸鼠移植瘤生长曲线显示,实验组比阴性对照组的肿瘤生长速度明显减慢(P<0.001);实验组和阴性对照组剥脱的瘤体体积分别为(61.65±6.44)mm3和(0.88±0.30)mm3,体积抑瘤率达(98.48±0.47)%,差异具有统计学意义(P=0.0020)。实验组和阴性对照组剥脱的瘤体重量分别为(4.29±1.39)mg和(410±80.97)mg,重量抑瘤率(98.90±0.46)%,差异具有统计学意义(P<0.0001)。3.免疫组化结果显示PLCE1沉默组的PLCE1、Ki-67和Bcl-2阳性率分别为(17.67±3.06)%、(7.33±1.53)%、(8.67±2.08)%,均低于各自阴性对照组(71.33±3.21)%、(20.67±4.01)%和(46.67±5.86)%,差异具有统计学意义(P=0.0030,P=0.0117,P=0.0064)。4.免疫荧光结果显示PLCE1沉默组PLCE1、Ki-67荧光强度降低,而Beclin-1蛋白荧光强度增强;PLCE1沉默组组移植瘤组织中凋亡细胞的数量(19.00±2.64)%显著高于对照组(10.67±2.08)%,P=0.0462。结论:沉默PLCE1可能是通过促进食管癌细胞Eca109的自噬和凋亡,从而抑制裸鼠移植瘤生长的;因此靶向作用PLCE1基因抑制肿瘤生长,有望成为食管癌癌治疗的新途径。
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