研究背景与目的胎儿和新生儿溶血病（Hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN）是影响胎儿及新生儿健康的免疫抗体IgG介导的疾病,其临床表现轻重不一。在新生儿医学发展史上,HDFN曾经是胎儿围产期死亡的重要原因,有资料显示其导致的胎儿死亡率大约占1%。经过多学科持续研究,尽管在诊断和治疗方面都取得了很大进展,但这一疾病的发病率和死亡率未能消除。大多数病例报道显示,最常见的是ABO和Rh血型系统IgG抗体引起的HDFN。随着抗-D免疫球蛋白（Rh Ig）产前产后的应用,抗-D引起的HDFN的发生率已由原来的50%降至0.1%。母胎ABO血型不相容已成为当今世界HDFN发生的主要原因,在我国,ABO-HDFN约占85.3%,在国外,ABO-HDFN约占66%。ABO-HDFN通常发病较轻,起病缓慢,容易误诊或漏诊,是导致新生儿二次入院的常见原因之一,但严重的病例报道也常见,甚至有报道称,这些孕妇所分娩的新生儿中30%患有HDFN,19%中度至重度溶血。目前,尚未建立针对母胎ABO血型不合系统的筛查程序,更无精准的预防措施,ABO-HDFN仍是威胁胎儿及新生儿健康的原因之一。因此需要提高对ABO-HDFN的重视程度,优化产前检测,以便早诊断早治疗,减少出生缺陷,提高生育质量。自1997年发现cff DNA（Circulating free fetal DNA,cff DNA）以来,人们一直致力于将其用于非侵入性产前检测的临床研究。近年来,随着医学科技的发展,cff DNA的基因组分布、组织起源、碎裂过程、长度特征、末端特征和拓扑形式逐渐被揭示;在妊娠期,母体外周血存在的cff DNA来源于胎盘组织,是胎盘滋养层细胞凋亡,以短片段形式释放至母体血液循环的,通常,在妊娠5-7周即可在母体外周血中检测到cff DNA;妊娠9-10周后,cff DNA在母体血液循环中已具有足够的量,可通过抽取少量母体外周血来获得;在妊娠11-13周时,cff DNA的浓度根据胎龄的不同在7.8%至13.0%之间;但与母体同体积的全血中完整有核血细胞提取的胎儿DNA相比,cff DNA的浓度几乎是其浓度的25倍。cff DNA的另外一些生理特征,也为我们提供了区分胎儿和母体游离DNA分子的依据。胎盘来源的cff DNA具有独特的甲基化特征,这些特征可作为标记,以证明cff DNA的存在。如在母体循环中胎盘来源的RAS相关结构域家族1A（RASSF1A）是高甲基化的,母体来源的RASSF1A是低甲基化的,游离DNA甲基化分析可以识别其来自胎儿或母体组织。孕期通过母体外周血浆收集cff DNA,简单方便,省时省力,安全无痛,避免感染、流产等风险;cff DNA检测现已成功用于临床诊疗活动,如胎儿性别鉴定,遗传疾病筛查,胎儿血型分型,也为孕妇进行无创产前筛查HDFN提供了机会。无创胎儿血型分型是一种敏感性极强的产前筛查方式,在丹麦、芬兰、比利时、瑞典、法国、德国等国家已成功开发了Rh D胎儿血型基因分型,并已应用于临床,针对其他血型的基因分型也有尝试,如Kell,由于ABO位点的巨大遗传变异特性,国内外尝试无创胎儿ABO血型分型的研究较少。本研究对ABO新生儿溶血病相关临床资料进行分析,发现胎儿ABO血型在ABO-HDFN预测中的潜力,拟通过在孕期提取母体外周血cff DNA进行实时荧光定量PCR（Real-time Polymerase chain reaction）技术扩增分析,预测胎儿ABO血型,结合孕期较高的IgG抗-A/B效价为确定发生HDFN的风险提供有价值的早期依据。方法（1）研究对象:选取2019年在河南省妇幼保健院孕期接受IgG抗-A/B效价检测的702例孕妇（中位年龄32岁,范围19-45岁）及其胎儿（出生中位胎龄39.5周,范围32-41周）为研究对象,其中100例（中位胎龄20周,范围13-35周）因首次检测IgG抗-A/B效价值较高,再次进行IgG抗-A/B效价检测时,同时接受无创胎儿ABO血型分型。所有孕妇血型均为O型Rh D阳性,配偶ABO血型为A型、B型或AB型,疑似存在母胎ABO血型不合,所有入组孕妇无糖尿病、高血压,无心、肝、肾、脑等疾病,无输血史,不规则抗体筛查结果阴性;所有胎儿均为单胎,无胎窘史,均在河南省妇幼保健院出生,不规则抗体筛查结果阴性,无引起溶血黄疸的其他血液疾病或其他血型不合引起的溶血。收集孕妇的年龄、孕史、孕期IgG抗-A/B效价结果,孕妇及其配偶的血清学血型鉴定结果,孕期保健时胎儿胎龄;追踪702例孕妇的妊娠结局,记录新生儿出生时胎龄、血型、性别、胎次和脐血胆红素结果;确诊患ABO新生儿溶血病的新生儿,记录新生儿溶血三项和不规则抗体筛查结果。该研究经河南省妇幼保健院伦理委员会伦理同意。（2）依据O型孕妇配偶不同的ABO血型血清学检测结果,将702例新生儿分为O-A（293例）、O-B（287例）和O-AB（122例）三组。（3）依照孕妇和新生儿ABO血型血清学检测结果,将702例新生儿分为O-A（255例）、O-B（224例）和O-O（223例）三组。（4）依据新生儿性别,将702例新生儿分为男性组（365例）和女性组（337例）。（5）将702例O型孕妇,按照孕史分为首次妊娠282（例）,再次妊娠（211例）和多次（≥3次）妊娠（209例）三组。（6）以702例O型孕妇孕期检测到的最高IgG抗-A/B效价为观察指标,比较孕期不同梯度的血清IgG抗-A/B效价中ABO-HDFN的发生率。（7）根据有无ABO-HDFN发生,将479例（A型和B型）新生儿脐血胆红素结果分为溶血组（112例）与未溶血组（367例）。（8）选取100例高抗体效价孕妇,采用Real-time PCR技术提取母体外周血cff DNA,进行产前无创胎儿血型检测,记录胎儿ABO血型分型结果,待胎儿娩出后,采集胎儿脐血进行血清学ABO血型鉴定,对比前后两次ABO血型检测结果。（9）ABO-HDFN诊断标准:母胎ABO血型不合（母亲O型、父亲非O型、胎儿非O型）;新生儿溶血三项试验（直接抗人球蛋白试验、游离抗体检测和放散试验）至少有1项为阳性;结合新生儿胆红素变化,血红蛋白和网织红细胞变化,及黄疸、贫血等临床表现诊断为ABO-HDFN。所有操作均按《全国临床检验操作规程》进行。（10）统计分析:使用统计软件SPSS26.0对数据进行分析,计数资料用n%表示,计量资料用中位数表示,非正态分布的数据采用非参数Mann-Whitney U检验;计数资料的组间分布比较采用χ~2检验,相关性分析采用非参数的秩相关,Spearman秩相关;二元Logistic回归分析ABO-HDFN发生的影响因素,ROC曲线评定胎儿期母体IgG抗-A/B效价联合脐血总胆红素预测ABO-HDFN模型预测效力,以P＜0.05,表示有统计学意义。结果（1）全部702例新生儿样本,血型分布:A型255例（36.3%）,B型224例（31.9%）,O型223例（31.8%）;性别比例:男性365例（52%）,女性337（48%）;ABO-HDFN发生:112例确诊ABO-HDFN（16%）,其中A型64例,占57.1%（64/112）,B型48例,占42.9%（48/112）;无创血型检测:100例孕期无创ABO血型分型胎儿,4例（4%）DNA提取失败,未继续试验,96例96%（96/100）分型成功;经脐血血型鉴定证实:A型37例占38.54%（37/96）,1例失败;B型34例占35.42%（34/96）,3例失败;O型25例占26.04%（25/96）,无失败;性别比例:男婴48例（48%）,女婴52例（52%）;ABO-HDFN发生:39例（39%）确诊,其中A型20例（51.3%）,B型19例（48.7%）;妊娠结局:5例早产（5%）,95例足月娩出（95%）。（2）配偶ABO血型不同,ABO-HDFN的发生率具有统计学差异（χ~2=6.728,P＜0.05）,配偶ABO血型为AB型时,ABO-HDFN发生率最高,与O-A组（χ~2=5.408,P＜0.05）和O-B组（χ~2=5.429,P＜0.05）比较,差异显著;O-A组与O-B组比较（χ~2=0,P＞0.05）,无显著差异。（3）702例新生儿,经ABO新生儿溶血标准判定112例确诊ABO-HDFN,确诊率16%（112/702）,母婴O-A不合者共255例,ABO-HDFN发病64例（25.1%）,O-B组224例,48例（21.4%）发生ABO-HDFN,二组发病率比较无统计学意义（χ~2=0.896,P＞0.05）。女婴确诊率15.1%（51/337）,男婴确诊率16.7%（61/365）,两组确诊率相比较,差异无统计学意义（χ~2=0.326,P＞0.05）。（4）702例新生儿中,首次妊娠组分娩282例新生儿,O型92例、其他型别190例,其中42例发生ABO-HDFN,发生率22.1%（42/190）;再次妊娠组分娩211例新生儿,O型新生儿69例、其他型别142例,其中30例发生ABO-HDFN,发生率21.1%（30/142）;多次妊娠组分娩209例新生儿,O型新生儿62例、其他型别147例,其中40例发生ABO-HDFN,发生率27.2%（40/147）;不同孕史组别ABO-HDFN发生率比较,差异无统计学意义（χ~2=1.779,P＞0.05）。（5）112例ABO-HDFN确诊病例在不同阶梯效价中的分布差异显著（χ~2=74.463,P＜0.05）,随着IgG抗-A/B效价的增高,ABO-HDFN确诊病例增多,IgG抗-A/B效价的变化与ABO-HDFN的发生呈正相关（r=0.355,P＜0.05）。（6）479例（A型和B型）新生儿脐血总胆红素（r=0.426,P＜0.01）和脐血间接胆红素（r=0.381,P＜0.01）与ABO-HDFN的发生相关显著。脐血总胆红素（Z=-9.308,P＜0.05）和脐血间接胆红素（Z=-8.327,P＜0.05）在溶血组和未溶血组中分布差异显著。（7）二元Logistic回归分析结果显示:母亲的孕史,胎儿A/B血型、性别不是ABO-HDFN发生的独立影响因素（P＞0.05）;抗体效价是ABO-HDFN发生的独立影响因素（P＜0.05）,若联合脐血总胆红素综合预测分析,ROC曲线下面积AUC=0.816。（8）100例胎儿ABO血型分型结果与新生儿脐血血型鉴定结果对比,96例一致,准确率96%,证明产前无创胎儿ABO血型检测的可行性,可用于指导临床。（9）进行无创ABO血型分型的100例胎儿,39例最终确诊ABO-HDFN,发生率39%（39/100）;4例ABO血型分型失败的胎儿均未发生ABO-HDFN,在产前96例胎儿成功ABO血型分型结果显示,A型者占比38.54%（37/96）,B型者占比35.42%（34/96）,O型者（母胎同型）占比26.04%（25/96）,临床需要观察的病例缩小至71例,39例患ABO-HDFN,总诊断率由39%提升至54.9%,二者比较具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.胎儿期采集母体外周血进行产前无创胎儿ABO血型分型,快速准确,可用于对疑似存在母胎ABO血型不合的高效价妊娠监测做临床指导。2.孕期母体IgG抗-A/B效价是ABO-HDFN发生的独立影响因素,但预测能力有限,若联合脐血胆红素检测,可提高预测值。