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DNA疫苗作为一种新型疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势,同时能诱导体液免疫和细胞免疫,而且抗原编码的“裸”DNA具有相对安全、稳定、生产方便和在体内能介导抗原的长期表达等优点。但是由于免疫原性相对较弱,目前DNA疫苗的发展仍然受到很大的限制。提高抗原基因的表达对提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用,抗原基因的优化策略包括:对质粒载体骨架调控元件的优化和利用宿主基因的偏好对密码子进行优化等。目前常利用人巨细胞病毒(hCMV)第一内含子(IntronA)作为转录后调节元件,与hCMV启动子/增强子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失内含子的目的基因的表达。有文献报道,乙肝病毒(HBV)/旱獭肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(H/WPRE)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)组成性转运元件(CTE)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)pre-mRNA加工增强元件(PPE)都能通过提高mRNA的稳定性、3’末端的加工、促进mRNA出细胞核和细胞质中mRNA的积累来增强未经剪接的基因表达。但是这类转录后调节元件是否能替代hCMVintronA或与其产生协同作用,从而提高DNA疫苗免疫原性还有待进行研究。本研究首先通过删除pVR1012质粒载体hCMVIE imronA,构建内含子缺失的质粒载体pCMV,然后将HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分别克隆入pVR1012和pCMV,获得了pIn-HPRE、pIn-WPRE、pIn-CTE、pIn-PPE和pHPRE、pWPRE、pCTE、pPPE载体。为比较hCMV IE intronA与HPRE、WPRE、CTE、PPE元件对目的基因表达的调控,将luciferase报告基因分别克隆入上述载体,体外瞬时转染293T细胞。实验结果表明,与pVR1012载体相比pIn-HPRE和pIn-WPRE能显著增强体外luciferase基因的表达,而pHPRE、pWPRE与pVR1012无差别。为比较HPRE、WPRE元件在hCMV IE intronA存在和缺失的情况下,对体外抗原基因表达及体内抗原特异的免疫反应增强效果的差异,将野生型或密码子优化型的HIV-1 B’/C重组亚型CN54株Gag基因克隆入携带HPRE、WPRE元件的pVR1012和pCMV的载体,体外瞬时转染293T细胞和免疫Balb/C小鼠进行比较。实验结果表明,PRE元件能够显著地提高野生型Gag基因在293T细胞中的表达,其中当hCMV IE intronA和HPRE元件在载体上同时出现的时候基因的表达水平最高,而且pInHGagw(+intronA/+HPRE)在10μg剂量诱导出的免疫反应水平高于pGagw(-intronA/-HPRE)以及pInGagw(+intronA/-HPRE)在40μg剂量所诱导的水平。虽然载体优化对提高体外和体内密码子优化型抗原基因表达作用不太明显,但研究结果发现,如果载体经hCMVIE intronA和HPRE元件的优化,那么即使携带野生型基因的载体也能达到与等量的密码子优化Gag DNA疫苗体外抗原基因表达和体内免疫原性相同的水平。大量的实验证明佐剂能够增强DNA疫苗的免疫原性。卡介菌的细胞壁骨架由分支菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖组成,能激活至少五种Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9),同时BCG中富含有免疫调节作用的CpG基序,因此它被认为是强有效的非特异免疫刺激剂,并在许多疫苗研究中得以使用。卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)是经热酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫调节剂,在临床上已经被成功地运用于免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病的治疗。本研究选择卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作为佐剂,评价了在不同剂量、不同免疫次数下BCG-PSN对pDRVI1.0gp1455M(HIV-1 CN54 gp145基因)DNA疫苗诱导的体液免疫,细胞免疫以及长期免疫记忆的增强作用。实验结果表明,BCG-PSN和DNA疫苗质粒混合后注射,能显著地提高DNA疫苗的免疫原性。并且BCG-PSN的使用能够减少DNA疫苗的免疫次数,降低DNA疫苗的用量。本研究为提高DNA疫苗免疫原性提供了新的途经,为开发中国株HIV-1 DNA疫苗奠定了坚实的基础。