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心肌肥大（cardiac hypertrophy）是多种心血管疾病共同病理、生理过程,是诱发心率失常、心肌梗死等心血管疾病的独立危险因子。血管紧张素II（angiotensin II,AngII）作为肾素-血管紧张素系统的重要组成部分,在心肌肥大进程中发挥重要作用。研究发现,降低细胞内线粒体损伤、钙离子超载和氧化应激状态能显著减轻AngII诱导心肌肥大作用,但深入的分子、细胞机制尚不清楚。20-羟二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE）是由细胞色素P-450（cytochrome P-450,CYP）酶催化花生四烯酸（arachidonic acid,AA）生成的具有生物活性的脂质介质。目前研究表明,20-HETE可以通过刺激平滑肌细胞收缩、迁移和增殖,激活内皮细胞功能障碍和炎症等机制,参与血管收缩调节,被认为是一种强缩血管物质,与多种心血管疾病密切相关。近年研究发现,20-HETE也参与了多种心脏疾病的发生发展,如心肌缺血再灌注损伤、细胞凋亡以及心肌肥大等。在心肌缺血再灌注损伤中,阻断其生成能有效减少心肌梗死面积,本课题组前期研究发现,20-HETE在直接作用于心肌细胞诱导肥大方面发挥重要作用,但具体深入机制还暨待进一步阐明。大量研究表明,在心肌细胞中20-HETE具有诱导细胞内钙超载、促进活性氧（reactive oxygen pecies,ROS）生成以及导致线粒体损伤等作用,这些效应可能与其诱导心肌肥大的作用密切相关。值得注意的是,这些作用与AngII诱导心肌肥大的机制具有相似之处。此外,在血管平滑肌细胞以及肾脏中,有研究证实AngII具有促进花生四烯酸代谢途径、诱导20-HETE生成的作用,而后者又参与了AngII的血管收缩效应。那么,在心脏中20-HETE是否通过诱导心肌细胞内过量ROS生成、导致心肌线粒体功能紊乱、钙超载等机制,参与AngII诱导的心肌细胞肥大?目前尚无相关文献报道,因此,本研究拟在H9c2心肌细胞中,探究20-HETE对AngII诱导的心肌细胞肥大作用的影响及其机制,为临床预防和治疗与AngII相关性心肌肥大疾病提供理论依据。目的:1.观察20-HETE在AngII诱导的心肌细胞肥大中的作用;2.探究20-HETE参与AngII诱导心肌细胞肥大的分子细胞机制。方法:传代培养H9c2心肌细胞,随机分为5组（n=6）:对照组（Control组）,AngII组（1μmol/L）,AngII+HET0016组（HET0016,10μmol/L）,HET0016组（10μmol/L）以及20-HETE组（100nmol/L）。各组心肌细胞不同药物处理24小时后,分别通过结晶紫染色检测细胞表面积;BCA法检测细胞总蛋白含量;qRT-PCR检测肥大基因ANP、BNP表达;细胞色素C还原法对NADPH氧化酶的活性进行检测;DHE荧光探针检测心肌细胞ROS含量;MitoSOX Red对心肌线粒体超氧化物的水平进行检测;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（Δ?m）;Flou-3/AM荧光染色激光共聚焦显微镜检测心肌细胞[Ca2+]i;Western Blot法检测心肌细胞CYP4A、CaN、NFAT3蛋白表达;ELISA法检测心肌细胞内20-HETE含量。结果:1.AngII对心肌细胞内CYP4A表达及20-HETE生成的影响与对照组相比,应用AngII处理H9c2细胞24h后,明显促进心肌细胞内20-HETE合成酶CYP4A表达增高,同时细胞内20-HETE含量显著增加（P<0.05）。2.阻断20-HETE生成对AngII诱导心肌肥大的影响与对照组相比,应用AngII（1μmol/L）处理H9c2细胞24h后,明显增加了心肌细胞表面积和细胞内总蛋白含量,心肌肥大标志物ANP和BNP的mRNA表达显著增高（P<0.05）。而应用特异性20-HETE合成酶抑制剂HET0016（10μmol/L）共孵育处理、减少20-HETE生成后,显著抑制了AngII的如上作用（P<0.05）。作为阳性对照,单独采用20-HETE（100nmol/L）处理后,亦与AngII相同具有明显的促进心肌肥大作用（P<0.05）。3.AngII及阻断20-HETE合成对心肌细胞ROS的影响AngII促进心肌细胞内ROS生成是其诱导心肌肥大的重要机制,因此我们检测了阻断20-HETE合成后对AngII诱导细胞内ROS生成的影响,发现HET0016共孵育组心肌细胞内ROS含量显著低于AngII组（P<0.05）;与对照组相比,20-HETE组心肌细胞内ROS含量亦显著增加（P<0.05）。NADPH氧化酶是心肌细胞内ROS生成的重要来源,HET0016与AngII共孵育处理、减少20-HETE生成后,显著降低了AngII诱导的NADPH氧化酶活性升高（P<0.05）;此外,单独采用20-HETE处理后亦具有显著增高NADPH氧化酶活性作用（P<0.05）。4.AngII及阻断20-HETE合成对线粒体超氧化物生成及膜电位（Δ?m）的影响心肌线粒体损伤是AngII诱导心肌肥大的另一重要机制,本研究发现,AngII组心肌细胞线粒体内超氧化物含量比对照组明显增加,同时Δ?m明显下降（P<0.05）,而应用HET0016共孵育、减少20-HETE生成后,显著抑制了AngII的如上作用（P<0.05）。此外发现,20-HETE同样具有与AngII相似的诱导线粒体超氧化物生成以及降低Δ?m的作用。5.AngII及阻断20-HETE生成对心肌细胞[Ca2+]i的影响心肌细胞内Ca2+浓度增加是诱发心肌细胞肥大的主要机制,因此本研究检测了AngII对心肌细胞[Ca2+]i的影响以及HET0016的作用,发现AngII具有显著增加H9c2心肌细胞[Ca2+]i的作用,而HET0016共处理后可阻断AngII该效应（P<0.05）。6.阻断20-HETE生成对AngII诱导的CaN、NFAT3蛋白表达影响为进一步探究20-HETE参与AngII诱导的心肌肥大机制,本研究检测了减少20-HETE生成对AngII诱导的Ca2+调节相关的CaN/NFAT3信号通路的影响。与对照组相比,AngII组心肌细胞内CaN、NFAT3蛋白表达显著增高（P<0.05）。而应用20-HETE合成酶抑制剂HET0016共孵育处理后,显著抑制了AngII的如上作用（P<0.05）。单独使用20-HETE处理后,亦具有明显的促进心肌细胞内CaN、NFAT3蛋白表达增高的作用（P<0.05）。结论:1.20-HETE通过诱导细胞内ROS生成、线粒体损伤机制参与AngII诱导的心肌肥大。2.20-HETE通过诱导钙超载激活CaN/NFAT3信号通路参与AngII诱导的心肌肥大。