神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚胎干细胞(mESCs)因其具有能分化成三个胚层细胞的多能性且不存在伦理问题而被广泛运用在各个研究领域。然而,体外mESCs的谱系特化是不同步且难以控制的,就神经谱系的特化而言,目前尚没有一个严格的标准用于指示mESCs的神经分化。神经祖细胞(NPCs)是指可以分化到多种神经元的神经前体细胞,是mESCs分化到神经元的中间态细胞,它既可以通过分离早期胚胎的大脑组织获得,也可以利用ESCs进行体外分化获得,其在临床细胞替代性治疗方面有很大的应用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的过程中,除实时观察细胞表型变化外,没有一个科学的系统行之有效地指示分化的进程,并且体外分化周期长,效率较低,导致最终获得的NPCs细胞数量不足以达到细胞替代治疗的需求,其根本原因还在于调控小鼠ESCs进行神经分化的分子机制尚不明确。因此,亟需一种高效和严谨的系统直观地对小鼠ESCs神经分化进程进行评估,进而推进神经分化、细胞替代治疗和药物筛选的研究。在本研究中,我们通过CRISPR/Cas9技术开发了一个内源性荧光标记的mESCs报告系统。在该系统中,Pax6基因后插入了一个GFP基因,使其共享同一启动子,故而能可视化地追踪神经分化过程。通过改进基于拟胚体介导分化的方法,在经过7天的分化后,我们可以通过流式分选技术高效地富集到NPCs。因此,我们建立了一种更简便、更快捷的方法富集到高纯度、多潜能的可进一步分化为功能性神经元的NPCs。该系统可作为一种理想的工具细胞运用于大规模神经分化相关基因和药物的筛选研究,为神经科学的研究铺平道路。