目的：构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF，探讨绿色荧光蛋白(Greenflurescentprotein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)体外培养和纯化方法，进一步观察人pcDNA3-β-NGF重组载体在GFP转基因小鼠BMSCs中的表达。 方法：采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-NGF的基因片段，将片段和真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和ApaI双酶切、纯化、连接、转化及筛选，从而构建重组载体pcDNA3-β-NGF。经酶切和测序对重组体进行分析和鉴定。 分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液，在3d按细胞类型对贴壁细胞分别计数并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。此外，选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养，在传第5代时，计算扩增倍数，用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。 用已构建的pcDNA3-β-NGF重组载体转染第5代的GFP转基因小鼠BMSCs，经G418筛选，用Westernblot和免疫细胞化学染色检测其表达。 结果：RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示：在预期位置有阳性条带。重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达β-NGF的基因。在原代培养中，随着首次换液时间的延长，贴壁细胞密度增多，BMSCs比例减少；2～4h首次换液细胞的纯度高而数目少，在16h后换液细胞的数目多而纯度降低；在8～10h首次换液的细胞纯度及数量均较高，传代后生长扩增情况好于其他时段换液的细胞。Westernblot和免疫细胞化学染色检测表明pcDNA3-β-NGF重组载体能在BMSCs中表达，而转染空载体及阴性对照组均无或较弱的表达。 结论：人β-NGF基因重组真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF构建成功。差速贴壁法培养和纯化GFP转基因小鼠BMSCs有效，首次换液时间在8h～10h时为佳，传代后细胞具有扩增能力，可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。所构建的pcDNA3-β-NGF真核表达载体在BMSCs中有良好的表达，为进一步研究联合运用BMSCs细胞替代治疗和β-NGF基因治疗奠定基础。