三氯生(Triclosan,TCS)作为一种非离子型卤代酚类广谱抗菌剂广泛使用于护肤品、牙膏、临床护理清洁液等。181名母亲志愿者的尿液和脐带血液中TCS检出率分别为100%和51%。母乳中也能检测到TCS。我们研究室的前期研究已报道,孕妇尿液中TCS浓度增加与自然流产的发生显示正相关。用100mg/kg高剂量TCS处理孕第5-18天小鼠能引起胎鼠的体重降低和死亡率增加。我们进一步观察到TCS暴露能引起孕鼠血中四碘甲状腺原氨酸(Thyroxine,T4)和三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyonine,T3)水平降低。临床资料显示,母亲的低甲状腺激素与胎儿宫内发育迟缓密切相关。TCS(10mg/kg)暴露引起孕鼠的T4和T3水平降低和胎鼠宫内发育迟缓。胎盘是母胎间交换物质的器官。胎儿的宫内发育依靠胎盘从母体摄得营养,而产生的废物经过胎盘排出。胎盘的营养物质转运与胎盘的发育和形态结构,氨基酸转运体和葡萄糖转运体的表达和功能活性有关。有研究证明,滋养细胞表达T3和T4受体,甲状腺激素通过激活PI3K-Akt-mTOR和ERK信号通路能刺激滋养细胞增殖和促进胎盘生长发育。此外,甲状腺激素也可以调节胎盘合体滋养细胞氨基酸转运体(SNAT1、SNAT2、SNAT4、TAUT)和葡萄糖转运体(GLUT1、GLUT3)的表达和功能活性。由此推测,孕鼠TCS暴露有可能通过降低T3和T4水平影响胎盘的发育和功能,从而导致胎鼠的宫内发育迟缓。研究目的:阐明TCS暴露对孕鼠胎盘发育的影响及其甲状腺激素介导的分子机制。实验方法:1.孕第6-18天ICR小鼠进行1,4,8mg/kg/day剂量的TCS灌胃。以下简称1-TCS孕鼠、4-TCS孕鼠和8-TCS孕鼠。2.胎盘用4%多聚甲醛固定和石蜡包埋。5μm切片进行苏木素-伊红(HE)染色,计算胎盘和迷路的体积。3.用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射,3小时后取出胎盘固定,石蜡包埋,进行BrdU和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色,进行BrdU阳性(BrdU+)和PCNA阳性(PCNA+)细胞计数。4.放射示踪法标记(14C-MeAIB,14C-Glucose)测量胎盘氨基酸和葡萄糖的转运功能。5.用酶联免疫法检测血清T4、T3、促甲状腺激素(TSH),雌激素(E2)和孕酮(P4),胎盘的白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)。6.用蛋白印迹法(Westernblot)检测Akt、mTOR、p70S6K、ERK1/2蛋白和磷酸、TNF-α蛋白。7.实时定量PCR检测胎盘PCNA、CyclinD3、SNAT1、SNAT2、SNAT4、TAUT、GLUT1、GLUT3。实验结果1.在妊娠第6-18天的8-TCS孕鼠,胎鼠的体重和存活率降低,而1-TCS孕鼠或4-TCS孕鼠没有发生胎鼠体重和存活率的改变。2.在妊娠第19天的8-TCS孕鼠,胎盘的重量减轻、总体积和迷路区体积减小,但是未出现胎盘血栓和组织坏死。同样,1-TCS孕鼠或4-TCS孕鼠也没有出现胎盘生长和发育的障碍。3.在妊娠第13天的8-TCS孕鼠,胎盘BrdU+细胞和PCNA+细胞数量明显低于对照孕鼠;PCNA和Cyclin D3 mRNA水平也明显降低,提示TCS抑制胎盘的细胞增殖。4.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠,14C-MeAIB和14C-Glucose在单位重量胎盘的水平明显低于对照孕鼠,但是单位重量胎儿体内的相对水平没有明显改变,提示TCS能破坏胎盘的营养物质(葡萄糖、氨基酸)转运。5.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠,无论胎盘氨基酸转运体SNAT1和SNAT4的表达水平或者葡萄糖转运体GLUT1都低于对照孕鼠,但是GLUT3和SNAT2表达无明显改变。6.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠,T3和T4的血清水平都低于对照孕鼠,伴有TSH水平增加,但是E2和P4水平没有明显改变。7.在妊娠第17天的8-TCS孕鼠,胎盘Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平明显降低,而ERK1/2磷酸化水平没有异常。对妊娠第15-17天8-TCS孕鼠进行L-T4(5mg/kg)处理能提高胎盘Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平,提示TCS诱导的低甲状腺激素可以抑制Akt-mTOR-p70S6K信号通路。8.对妊娠第10-13天8-TCS孕鼠进行L-T4处理能增加胎盘Brdu+细胞和PCNA+细胞数量。对妊娠第15-17天TCS-孕鼠进行L-T4处理能改善14C-MeAIB和14C-Glucose通过胎盘的转运功能,增加存活胎鼠的体重。mTOR抑制剂雷帕霉素处理能阻断L-T4对胎盘细胞增殖,营养物质转运和胎鼠发育的保护作用。总结孕鼠进行TCS暴露能引起甲状腺激素水平降低,抑制Akt-mTOR-p70S6K信号通路,抑制胎盘的细胞增殖和葡萄糖转运体/氨基酸转运体表达,破坏胎盘的发育和营养物质的转运,导致胎鼠宫内发育不良。