吸毒是目前世界范围内重大的社会问题,毒品成瘾(drug addiction)影响着人类的健康、社会的稳定。全世界每年约20万人死于吸毒,我国登记在册的吸毒人数有100万左右,但实际人数远远不止这个数。毒品成瘾已经成为了我国日益严重的社会问题。毒品成瘾是指不择手段、不记后果地强制性地获取、使用某种毒品。对毒品的依赖性一旦形成,即可能伴随终生,它具有极高的复发性,甚至在戒断多年后仍有可能复发,对社会造成很严重的危害。开展毒品成瘾机制的研究,并进一步寻找有效的治疗成瘾的药物,具有深远的社会意义,刻不容缓。毒品成瘾性的形成是一个综合性的过程,受多种因素调控,既受心理性、社会性因素影响,也受基因遗传性因素影响。而毒品依赖性的形成是一个循序渐进的过程,在此过程,机体在分子、细胞学水平发生了代偿性变化,包括基因表达的变化和神经元形态的变化,这些代偿性的变化改变单个神经元的功能,进而影响神经通路的功能并最终导致行为学上的一系列改变。近年的研究发现,Rho家族信号通路在药物成瘾过程中起着重要的作用。Rho家族包括Rho,Rac1和Cdc42,属于Ras家族小GTPases家族成员,据文献报导,Rho家族在细胞骨架调节、细胞形态发生与细胞迁移中起重要调控作用cdc42在调控细胞骨架、细胞增殖,基因转录与细胞迁移中起着重要的作用。Cdc42分别以活化的GTP-Cdc42和无活性的GDP-Cdc42形式存在。活化的GTP-Cdc42与其下游的效应分子结合,从而导致一系列的生物学事件。Cdc42与Rho-鸟苷三磷酸交换因子(Rho-GEFs)间有着重要的联系。细胞外信号分子通过激活相应的信号转导通路而调节树突树与树突棘的生长、分支与重构,进而影响神经元的功能。近年来,众多研究证实Rho家族在细胞骨架调节、神经元形态发生与神经元迁移中(migration)起重要调控作用。Rho家族在神经元树突结构与可塑性的形成中起重要的作用。应用Rho家族活性突变体(constitutively active mutant)与负显性突变体(dominant negative mutant)实验发现cdc42参与神经元树突生长、分支与分支稳定性等多项生物学事件的调节。业已证明,树突树与树突棘结构的修饰和重构参与学习与记忆相关的神经元可塑性(plasticity)的形成。Cdc42在神经元树突结构可塑性形成中起着重要的作用,但是cdc42是否参与可卡因诱导的神经元树突重塑尚不清楚。我们利用Cre/loxP系统构建了cdc42前脑特异性基因敲除小鼠(cdc42基因全身性敲除为胚胎致死性),而且我们这个基因的敲除为渐进性敲除,CamKII-Cre启动子在小鼠出生后三周开始表达,敲除区域从海马CA1区开始,到整个海马,到纹状体,随着年龄的增长,敲除区域不断扩大。我们利用3月龄和6月龄的cdc42前脑特异性基因敲除小鼠进行一系列行为学实验,首先观察cdc42的敲除是否影响小鼠的基础行为学,这些基础的生理机能包括焦虑与抑郁的表现、自主活动能力、学习记忆能力。进一步,制备可卡因成瘾模型,利用条件位置偏爱实验与行为敏化实验揭示cdc42是否参与了小鼠可卡因成瘾行为学的形成。首先进行PCR实验鉴定出我们需要的基因敲除小鼠,然后针对cdc42前脑特异性基因敲除小鼠进行了系列基础行为学检测,同时也对同龄的WT(wild type)小鼠进行相同的检测,包括高架迷宫实验(elevated-plus maze)、强迫游泳实验(forced swimming test)、悬尾实验(tail suspended test)、旷场实验(open-field test)、自发活动实验(spontaneous test)、水迷宫实验(morris water maze)。进一步,进行了可卡因成瘾行为学实验,包括条件位置偏爱实验(Conditioned placepreference)、行为敏化实验(behavior sensitization).本研究的主要结果如下：1、利用PCR进行基因表型鉴定：cre的特异性条带为600 bp, loxp的条带大小为700bp,小鼠被鉴定出同时具备这两条条带,为我们需要的基因敲除小鼠。2、Cdc42前脑特异性敲除对小鼠基础学习记忆能力的影响：在水迷宫实验(morris water maze)中,在训练过程中两组逃避潜伏期的变化(escape latency),3月龄KO小鼠较3月龄WT小鼠相比,无统计学差异；6月龄KO小鼠与6月龄WT小鼠相比,有统计学差异(p<0.05);经过相同时间的训练后,3月与6月龄的KO小鼠在测试天的指标：目标象限的路程的百分比、时间的百分比、穿越平台的次数与相应的WT组相比,都比WT组少,有统计学差异(p<0.05)。游泳的平均速度无统计学差异。3、Cdc42前脑特异性敲除对小鼠基础焦虑行为的影响：在高架迷宫实验(elevated-plus maze)中,3月与6月龄的KO小鼠,它们在规定时间内进入开臂的次数以及开臂滞留时间与相应的WT小鼠相比,无统计学差异。4、Cdc42前脑特异性敲除对小鼠基础抑郁行为的影响：在迫游泳实验(forced swimming test)、悬尾实验(tail suspended test)中,3月与6月龄的KO小鼠,它们在规定时间内的绝对不动时间与相应的WT小鼠相比,无统计学差异。5、Cdc42前脑特异性敲除对小鼠自主活动的影响：在旷场实验(open-field test),3月与6月龄的KO小鼠,它们规定时间内的总路程与相应的WT小鼠相比,无统计学差异,运动速度两组相比无统计学差异。6、Cdc42参与了可卡因成瘾小鼠条件位置偏爱的形成：在条件位置偏爱实验中,分3个月龄6个月龄两个年龄段进行实验,第一天不给药,放入中间箱,适应环境,第二天测试小鼠的天然偏爱(偏爱黑箱),后隔天分别给予生理盐水及可卡因刺激,剂量按20mg/kg给予,给生理盐水放入黑箱,给可卡因放入白箱,如此训练三次六天,后测试,发现两个年龄段的cdc42前脑特异性基因敲除小鼠与相应年龄的WT小鼠相比,cdc42基因敲除小鼠的训练前后在白箱停留的时间差明显比WT小鼠短,有统计学差异(p<0.05),说明cdc42参与了条件位置偏爱的形成。7、Cdc42参与了可卡因成瘾小鼠行为敏化的形成：在行为敏化实验的整个过程中,分3个月龄6个月龄两个年龄段进行实验,首先给予四天的生理盐水刺激,每天一针,剂量按20mg/kg给予,3月龄的KO小鼠与WT小鼠相比,自主活动次数无统计学差异。6月龄的KO小鼠与WT小鼠相比,自主活动次数无统计学差异。之后连续七天,每天给予一针可卡因刺激,剂量按20mg/kg给予,给予刺激后立即放入自主活动箱中,记录刺激后1小时内的自主活动次数,发现两个年龄段的两个组相比,KO小鼠给予可卡因刺激后,自主活动次数明显增加,有统计学差异(p<0.05)。在第19天再给予与之前同剂量的可卡因challenging,发现两个年龄段的两个组相比,KO小鼠的自主活动次数较WT小鼠明显增加,有统计学差异(p<0.05)。也说明cdc42参与了行为敏化的形成。通过上述研究,我们得出以下结论：一、成功的构建了cdc42前脑特异性基因敲除小鼠,为下一步的研究打下了坚实的基础。二、水迷宫实验提示cdc42前脑特异性敲除影响了小鼠的基础空间学习记忆能力,基因敲除小鼠的基础空间学习记忆能力明显下降。三、在高架迷宫实验中发现,cdc42前脑特异性敲除并未影响小鼠的基础焦虑行为。四、在悬尾、强迫游泳实验中发现,cdc42前脑特异性敲除并未影响小鼠的基础抑郁行为。五、在旷场实验中可以看出,cdc42前脑特异性敲除并未影响小鼠的基础自主活动行为。六、cdc42参与了可卡因成瘾小鼠条件位置偏爱的形成,基因敲除小鼠条件位置偏爱的形成比WT更加缓慢。七、cdc42参与了可卡因成瘾小鼠行为敏化的形成,cdc42前脑特异性基因敲除小鼠的活动比WT小鼠更加活跃。综上所述,本研究成功构建了cdc42前脑特异性基因敲除小鼠,并利用一系列的行为学实验来验证cdc42前脑特异性敲除对小鼠的影响,也验证了cdc42在cocaine成瘾过程中的作用。结果表明,cdc42的前脑特异性敲除对小鼠的基础抑郁、焦虑、自主活动行为并无影响,但影响了小鼠的基础空间学习记忆能力,它的敲除明显的降低了小鼠的空间按学习记忆能力。cdc42也参与了小鼠cocaine成瘾行为的形成,在行为敏化实验中,基因敲除小鼠的活动比WT小鼠更加活跃,而在条件位置偏爱实验中,基因敲除小鼠条件位置偏爱的形成比WT更加缓慢。本研究提示cdc42在cocaine成瘾的过程中起着重要的作用,也为下一步筛选成瘾戒断药物提供启示。