前言：　　 由于外伤、肿瘤术后及先天畸形等原因常造成颌骨组织缺损，导致咀嚼功能丧失、影响面部美观。为了满足修复治疗的需要，广大学者尝试了大量骨组织缺损修复的方法，组织工程构建人工骨是修复骨缺损较为理想的方法之一[1，2]，其基本方法是将体外培养扩增的种子细胞，接种于合适的支架材料中形成复合物，植入机体，随着支架材料的降解，种子细胞持续增殖分化，直接参与，并分泌基质，释放必须的细胞因子，从而加速骨缺损的修复[3]。目前骨组织工程技术取得了较大的进展，但仍存在一些问题，如骨形成的量有限，难以构建大块骨组织，成骨的速度比较慢，不能较早行使功能等[1]。　　 研究发现，组织工程化骨植入体内早期营养主要来源于组织液的渗透和血液的融附，进入支架内深度有限，中央的细胞供血和供氧受到限制。植入体内后内部细胞可因营养成份缺乏而导致细胞变性坏死。单纯人工骨构建方法存在静态培养条件下厚度受限，无法对于大面积缺损进行重建。　　 随着组织工程技术的进展，有学者提出了血管化人工骨的设想，即在以往基础上，通过各种方法将血管形成引入人工骨的构建，促进其早期形成血管组织并为形成的骨组织提供营养[4]。血管化能将成骨细胞前体细胞、相关生长因子、营养物质等携带到局部微环境中，并带走局部代谢产生的废物及坏死分解产物[5]。因此，血管化在骨组织工程中有重要意义，血管化人工骨成为具有广泛应用前景的组织工程修复骨缺损方法[6]。　　 骨的形成是由多种细胞和细胞外基质共同参与，受多种生长因子和激素调控的复杂生理活动。构建血管化的组织工程骨，细胞选择是一个重要问题[7]。　　 骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cell，BMSC)是常用的骨组织工程干细胞，具有高度的可塑性和多向分化潜能[8]，在体外具有高度的扩增能力，可被诱导分化为骨、软骨、肌肉、脂肪和神经等组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，是组织工程中一种理想的供体细胞[9]。　　 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是出生后骨髓中存在的能够迁移到外周循环中的一群祖细胞，可以分化为成熟的内皮细胞。在胚胎发育的过程中，EPCs参与了最初的血管形成[10]。成人中，内皮祖细胞定居于骨髓，并且可以被细胞因子或者来自于外周血中的血管生长因子信号动员到外周循环而进入外周血管组织中，通过整合进血管壁或提供生长因子两种方式来促使新生血管的形成[11]。近年研究发现EPCs通过释放生长因子、炎症介质等内容物及直接与骨细胞接触，参与骨形成和修复的生理过程[12]。有学者研究表明，EPC在组织工程化血管中起着重要作用[13]。　　 我们将血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞共培养，作为骨组织工程的种子细胞，构建了纳米硫酸钙/藻酸盐支架，作为Ad-BMP2-BMSCs与EPCs的载体，研究使用该体系构建血管化骨的可行性。　　 材料和方法：　　 一、实验材料　　 1、主要试剂、仪器（略）　　 二、实验方法　　 1、纳米硫酸钙的制备：真空冷冻干燥法制备纳米硫酸钙.辉光放电处理消毒备用。　　 2、纳米硫酸钙/藻酸盐支架的制备：Y型针法制备纳米硫酸钙/藻酸盐支架，制备不同比例支架，进行性能检测。　　 3、支架流动性、机械强度检测：通用测试仪测试材料流动性、机械强度。　　 4、支架吸水率、孔隙率、孔径检测：取支架材料称重法计算吸水率，液体置换法计算孔隙率，扫描电镜测定支架孔径。　　 5、细胞毒性检测：MTS法测定材料的细胞毒性，并用扫描电镜观测支架材料上细胞黏附情况。　　 6、骨髓间充质干细胞培养鉴定：贴壁法获得骨髓间充质干细胞，流式细胞仪，免疫荧光染色检测细胞表面阳性标志物CD44，CD90与阴性标志物CD31，CD34。　　 7、EPC的分离培养鉴定：利用密度梯度离心法从骨髓中获得单核细胞，利用差速贴壁法分离EPCs。流式细胞仪检测细胞表面阳性标志物CD34，CD133，阴性标志物CD31，CD45，免疫荧光染色检测凝集素。　　 8、Ad-BMP2转染BMSC：培养HEK293细胞，扩增病毒，纯化，病毒滴度测定后转染BMSC，ELISA试剂盒分析BMP-2分泌情况。ALP试剂盒测定ALP合成情况，用DNA对ALP结果进行标准化。　　 9、成骨、成血管相关基因表达情况：病毒转染后收集转染和未转染组细胞，以Trizol提取细胞总RNA，以不同引物进行RT-PCR反应，检测成骨相关基因OCN，COL1，BMP2以及成血管相关基因VEGF在mRNA水平的表达情况。　　 10、BMSC/EPC共培养体系的建立：将BMSC与EPC分别按不同比例接种于6孔板内，对照组为BMSC，EPC。检测各组在不同条件下碱性磷酸酶活性。确定共培养细胞比例。　　 11、Ad-BMSC/EPC体系中成骨成血管相关基因mRNA表达情况：检测成骨相关基因OCN，ColI，BMP2，成血管相关基因VEGF，cdh5，VEGF，vWF等基因mRNA表达情况。　　 12、Ad-BMSC/EPC的体外成骨能力：Von kossa染色观察Ad-BMSC/EPC的体外成骨能力。　　 13、纳米硫酸钙/藻酸盐支架复合Ad-BMSC/EPC后碱性磷酸酶情况分析：纳米硫酸钙/藻酸盐支架成型后，接种Ad-BMSC/EPC于支架上，成骨培养基诱导后，收取细胞，观察细胞碱性磷酸酶合成情况。　　 14、纳米硫酸钙/藻酸盐支架复合Ad-BMSC/EPC成骨相关蛋白合成分析：细胞接种后，成骨培养基诱导，Western blotting法检测OCN，ColI蛋白合成情况。　　 15、大鼠颅骨临界缺损模型的建立：8周SD大鼠随机分为6组：blank组(无细胞、材料)，空白支架组，BMSC/支架组，Ad-BMP-BMSC/支架组，BMSC+EPC/支架组，Ad-BMP-BMSC+EPC/支架组。麻醉，消毒、铺巾。大鼠头顶部正中做纵行切口，全层翻开骨膜，直径8mm的钻头盐水冷却下制备直径颅骨全层圆形缺损区，植入材料分层缝合。　　 16、骨密度测量：CO2处死动物，剥离头部皮肤及肌肉组织，取颅骨测量骨密度，LUNARPIXImus软件进行骨密度分析。　　 17、HE染色、免疫组化染色：将标本使用10％中性甲醛固定48h，然后将其置于脱钙液反应7d。经过逐级乙醇梯度脱水后石蜡包埋，切片，行常规HE染色、免疫染色。　　 结果：　　 1、支架基本性能检测材料流动性较单纯硫酸钙有所下降，随藻酸盐材料的浓度增加而逐渐降低。支架材料为多孔结构，孔隙率约为85%，吸水率108%孔径约为60um。细胞接种到支架后，生长良好，与普通孔板贴壁培养的对照组比较，无统计差异，扫描电镜结果，显示细胞与支架材料上贴附良好。　　 2、骨髓间充质干细胞培养鉴定流式细胞仪及免疫组化证实所培养细胞为间充质来源细胞。　　 3、EPC的分离培养鉴定流式细胞仪及免疫组化证实所培养细胞为内皮祖细胞。　　 4、Ad-BMP2转染BMSC后成骨、成血管相关基因表达上调Ad-BMP2转染的BMSC中BMP2合成增加，4天时BMP2分泌达到峰值碱性磷酸酶合成增加，成骨相关基因OCN，ColI，BMP2以及VEGF的mRNA表达均有上调。　　 5、Ad-BMSC/EPC体系中成骨成血管相关基因mRNA表达上调共培养体系中成骨相关基因OCN，ColI，BMP2以及成血管相关基因VEGF，cdh5，VEGF，vWF等基因mRNA表达均上调。　　 6、Ad-BMSC/EPC的体外成骨能力增加Von Kossa染色结果显示Ad-BMP2-BMSC/EPC组钙化结节形成明显增多。BMSC/EPC组与Ad-BMP2-BMSC钙化结节形成情况也高于BMSC对照组。　　 7、纳米硫酸钙/藻酸盐支架复合Ad-BMSC/EPC后碱性磷酸酶活力上升细胞接种于支架后，MSC组较平板培养活力有所下降，但无统计学差异，其余各组碱性磷酸酶活力上升。　　 8、纳米硫酸钙/藻酸盐支架复合Ad-BMSC/EPC成骨相关蛋白合成增加细胞接种支架后，成骨诱导，提取细胞总蛋白进行western-blotting结果显示，Ⅰ型胶原，骨钙蛋白合成量增加。其中以Ad-BMP-MSC/EPC组最为明显。　　 9、大鼠颅骨临界缺损模型骨密度测量空白对照组、单纯材料组的成骨现象也不明显。支架/BMSC复合体骨缺损部位有明显成骨的影像学表现，骨缺损部位密度增高，但仍低于正常，Ad-BMP2-BMSC/支架组新骨形成情况与BMSC/EPC组相似，新骨形成量高于BMSC组，缺损周边骨密度增加明显，在Ad-BMP2-BMSC/EPC/支架组可见大部分骨缺损被修复，部分样本骨缺损以全层修复完毕，且密度与正常骨组织接近。　　 10、HE染色、免疫组化染色组织学切片结果显示，空白对照组和空白支架组，缺损区仅有纤维结缔组织覆盖。BMSC复合支架组有骨样组织形成，周边较厚，中间薄，Ad-BMP2-BMSC组中，BMSC/EPC组大部分缺损区被骨样组织覆盖，新骨样组织厚度较Ad-BMP2-BMSC组高。Ad-BMP2-BMSC/EPC成骨情况最好，全层为骨样组织修复，厚度较厚较均匀。免疫组化染色显示含有EPC的实验组中，血管密度高于其它组。　　 结论：　　 1、纳米硫酸钙/藻酸盐支架有良好的生物学性能，有良好的流动性和机械强度，在动物体内无明显的刺激反应，可作为细胞支架用于骨组织缺损的修复。　　 2、Ad-BMP2-BMSC/EPC在混合培养后，碱性磷酸酶活力上升，成骨，成血管相关基因mRNA表达量上调。体外成骨能力增强，可以用作骨组织工程的种子细胞。　　 3、通过应用Ad-BMP2-BMSC/EPC复合纳米硫酸钙/藻酸盐支架修复大鼠骨缺损，证实其有明显的成骨效应，可以作为组织工程方法修复骨缺损的选择方式。　　 4、在有EPC存在的实验组中，新生成骨内骨量，血管密度高于单纯BMSC组。