镉（Cd）是广泛存在于自然界的一种重金属元素,一氧化氮（NO）是一种普遍存在于生物界的信使分子,广泛参与植物对各种环境胁迫包括Cd胁迫的应答与反应和调控的过程,紫花苜蓿（Medicogo sativa L.）具有清除土壤中高含量Cd、Cu或Zn的能力,是一种很有潜力的土壤修复植物。而对于作物整个生长周期而言,种子的萌发过程是生理代谢最旺盛的阶段。本实验用氯化镉（CdCl₂）模拟Cd胁迫,采用NO供体SNP（Na₂[Fe（CN）₅NO]?2H₂O）、硝酸还原酶（NR）非专一性抑制剂叠氮化钠（NaN₃）、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NAME（N’-nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride）和NO专性清除剂c-PTIO（2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）分别处理紫花苜蓿种子,通过分析Cd胁迫下紫花苜蓿种子内源NO的产生及产生途径,NO对Cd胁迫下紫花苜蓿种子萌发生长、贮藏物质积累、膜脂过氧化、抗氧化酶系统、渗透调节物质和Cd含量的影响,探讨NO在植物逆境胁迫响应中的作用及其机理。结果表明:（1）Cd胁迫增加了紫花苜蓿种子萌发过程中内源NO的产生,表明NO信号与紫花苜蓿种子抵抗Cd胁迫有关。从处理第一天到第五天,NO含量总值呈现显著性变化。随着Cd处理浓度的增大,NO含量总体呈现上升趋势,或先上升后下降但各处理浓度下NO含量均显著高于对照,这表明Cd胁迫下紫花苜蓿种子萌发过程中有内源NO的产生,且在50μmol/L Cd胁迫下NO产生量达到最高峰。本研究选取了NOS、NR活性,亚硝酸根离子（NO₂^-）、类胡萝卜素（Car）含量四个参数作为内源NO产生途径的代表。结果表明,随着Cd处理浓度的增大,第一天、第三天和第四天的NOS活性呈现明显的剂量效应,即低浓度下增强,高浓度下减弱的效果;第二天和第五天的NOS活性总体呈现逐渐增加的趋势。Cd处理使紫花苜蓿种子体内的NO₂^-、Car含量发生了显著变化。随着Cd处理浓度的增大,紫花苜蓿种子体内的NO₂^-、Car含量总体呈现先升高后降低的趋势。四项指标总体均与NO含量变化规律相似,表明Cd胁迫能诱发紫花苜蓿种子萌发过程中内源NO的产生,主要通过NOS催化,及NO₂^-在NR催化作用下或在Car和光的介导作用下产生。不同浓度Cd处理下,NR五天的活性总量相对NOS活性、NO₂^-和Car含量而言更平稳,说明苜蓿种子萌发过程中NR活性受Cd浓度影响相对较小。第二天的NO含量较第一天相比有总体下降的趋势,这与NOS、NR、NO₂^-早期变化规律均相似,说明种子萌发初期NOS、NR、NO₂^-可能起主要的调控作用。第三天至第五天NO含量逐步增加,这与NOS、Car、NO₂^-后期变化规律相似,说明种子萌发后期NOS、Car、NO₂^-可能起更主要的调控作用。总体而言,50μmol/L Cd处理使NOS、NR活性,NO₂^-、Car含量显著增加,NO含量升高也最显著。（2）Cd胁迫显著抑制了紫花苜蓿种子萌发和生长,使发芽率、发芽势、种子活力指数和发芽指数,胚芽长和胚根长以及胚芽、胚根鲜重较对照（CK）显著降低。外源SNP处理能使上述参数较CK显著升高,而Cd胁迫下SNP处理能缓解Cd胁迫对紫花苜蓿种子萌发和生长的抑制作用,使上述参数较Cd单独处理显著升高,SNP的缓解作用却被NO的清除剂c-PTIO处理抵消,使上述参数较Cd+SNP相比显著下降,表明Cd胁迫可诱导内源NO产生,外源和内源NO都参与了紫花苜蓿种子对Cd胁迫的响应过程,能缓解Cd胁迫对植物萌发和生长的抑制,増加发芽率、发芽势、种子活力指数和发芽指数,胚芽长和胚根长以及胚芽、胚根鲜重。逆境胁迫下,NOS和NR通过产生NO在植物发挥着重要的作用。本研究中,Cd胁迫下,L-NAME、NaN₃、NaN₃+L-NAME处理使胚芽长和胚根长较Cd单独处理显著降低。L-NAME处理下种子胚芽长和胚根长显著高于NaN₃处理。发芽率和发芽势、发芽指数和种子活力指数以及胚芽鲜重、干重有着相似的规律。说明NaN₃、L-NAME通过对NR、NOS的抑制显著阻碍了紫花苜蓿种子萌发和生长,进而表明NR和NOS能通过促进内源NO的产生,增加Cd胁迫下紫花苜蓿种子发芽率和发芽势、发芽指数和种子活力指数,胚芽、胚根长以及胚芽鲜重、干重,缓解Cd胁迫对种子萌发的抑制,且在促进紫花苜蓿种子萌发和生长方面,NR可能比NOS起着更主要的作用。（3）发芽过程的特征是通过储存物质,如碳水化合物和蛋白质等通过水解酶水解新形成的物质用于形成新的结构。储存物质被水解酶水解为呼吸作用和各种合成代谢反应提供能量,以形成代谢产物。负责这些储备物质如淀粉分解的酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶,已有报道显示,Cd胁迫会导致储备物质的动员受到限制。本研究中,Cd胁迫显著抑制了紫花苜蓿种子萌发过程中贮藏物质的积累,使还原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性较CK显著降低。而Cd胁迫下,SNP处理能缓解Cd胁迫对紫花苜蓿种子萌发过程中贮藏物质积累的抑制作用,使上述参数较Cd单独处理显著升高,SNP的缓解作用可被NO的清除剂c-PTIO处理抵消,使上述参数较Cd+SNP相比显著下降,表明Cd胁迫诱导内源NO产生,NO参与紫花苜蓿种子对Cd胁迫的响应过程,缓解Cd胁迫对植物贮藏物质积累的抑制作用,増加还原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量,促进α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。Cd胁迫下,L-NAME、NaN₃、NaN₃+L-NAME处理使可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性较Cd单独处理显著降低。相似地,与CK相比,NaN₃、L-NAME、NaN₃+L-NAME处理均显著抑制了种子体内的还原性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。说明NaN₃、L-NAME通过抑制NR、NOS的活性从而显著抑制了紫花苜蓿种子萌发过程中贮藏物质的积累,表明内源NO缓解Cd胁迫对种子萌发过程中贮藏物质积累的抑制,减轻Cd迫害。（4）作为活性氧化还原金属,Cd能够诱导各种非生物胁迫下在幼苗中产生的ROS,如O₂^-·和H₂O₂的过度产生,这又导致膜脂过氧化;为了应对和中和ROS的毒性,植物发展的内源性抗氧化酶系统包括CAT,POD,SOD,APX,GR等抗氧化酶。本研究中,Cd胁迫下,紫花苜蓿种子体内的MDA、H₂O₂、O₂^-·含量、REC与CK相比显著升高,而SOD、CAT、POD、APX、LOX活性也相应增强,进一步阐述了上述观点,说明苜蓿通过增强抗氧化酶活性来缓解Cd胁迫引起的膜脂过氧化,从而提高对Cd胁迫的抗性。而Cd胁迫下,SNP处理使种子体内的MDA、H₂O₂、O₂^-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性较Cd单独处理显著降低,说明Cd胁迫引起了活性氧（ROS）自由基的增加,致使紫花苜蓿种子发生膜脂过氧化,而外源NO的添加对膜脂过氧化现象有缓解作用;SNP的缓解作用可被c-PTIO处理抵消,使上述参数较Cd+SNP显著升高,说明对苜蓿种子体内NO的清除会引起活性氧自由基含量水平的增加,进而激发抗氧化系统作用。Cd胁迫下,NaN₃、L-NAME、NaN₃+L-NAME处理使种子体内的MDA、H₂O₂、O₂^-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性较Cd显著升高,说明NaN₃、L-NAME通过抑制NR、NOS的活性引起了种子体内活性氧自由基含量水平的增加,进而说明内源NO可通过调节细胞氧化还原稳态的一般机制,通过增强抗氧化酶活性,清除H₂O₂,促进O₂^-·转化为H₂O₂和O₂,缓解植物的氧化损伤。在总体水平上,随着时间的推移,MDA、H₂O₂、O₂^·-、REC、Pro含量水平呈现逐渐积累的水平;而SOD、CAT、APX、GR活性亦呈逐渐增加的趋势。说明随着时间的延长,Cd诱导这些分子的过度积累导致了紫花苜蓿种子中的氧化损伤并抑制幼苗生长。另一方面,POD、LOX活性则呈现总体先降低后升高的趋势,表明NO和POD、LOX活性诱导之间的关系较为复杂,具体原因还需进一步研究得知。（5）未外加Cd处理时,紫花苜蓿种子体内Cd含量极低,而SNP、L-NAME、NaN₃、L-NAME+NaN₃、c-PTIO均使苜蓿体内Cd含量水平显著提高,疑似出现“假阳性”效果,原因有待进一步研究。Cd胁迫下,外源SNP处理使种子体内Cd积累量较Cd单独处理显著升高,积累量为24.945μg/g;SNP的促进效果可因c-PTIO的添加而被抵消,使Cd积累量较Cd+SNP显著降低;说明外源NO在促进植物生长发育的同时,也增加了植物对Cd的吸收,这与前人在紫花苜蓿幼苗中得到的结论不一致,可能是由于NO促进了Cd的吸收,而部分Cd与一些络合物结合而失活,从而未使Cd的积累对种子萌发造成致命的损伤。Cd胁迫下,L-NAME、Na N3、L-NAME+NaN₃处理使Cd积累量较Cd单独处理显著降低。说明苜蓿体内NO的清除和NOS和NR活性的抑制会降低苜蓿对外界Cd的吸收,这说明内源NO参与了紫花苜蓿种子对Cd胁迫的调控,增加了对外界Cd的吸收及积累。总体来说,Cd胁迫诱导了内源NO的产生,内源NO在紫花苜蓿种子萌发及胚生长、贮藏物质、活性氧代谢及Cd积累方面均有显著调控作用,而外源NO的添加能促进这种调控作用,逆转Cd对种子萌发及生长的负面影响。对NOS、NR活性的抑制及对NO的清除均会抵消SNP处理所带来的积极作用。本研究促进内源NO生成的最佳Cd浓度为50μmol/L。紫花苜蓿在修复重金属如Cd、Cu、Pb等污染土壤方面的能力非常突出,而在中国有大面积种植紫花苜蓿作为畜牧业发展的基础,由此可见其在应对逆境环境下的发展前景很广阔。光合作用是植物新陈代谢以生长的基本生理活动,对于NO在Cd胁迫下对紫花苜蓿净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、叶绿素荧光参数以及叶黄素循环是怎样影响的还有待探讨,这是下一步研究的方向和目标。建议进一步采用遗传和蛋白质组学分析及其他生理学方法,以了解外源NO在植物代谢功能中的细节,这将有助于进一步了解这种多面体化合物,用于植物缓解不同种类生物和非生物胁迫,使紫花苜蓿能够更好的应用于重金属污染土壤的植物修复中。