随着科学技术的发展，基因治疗逐渐成为今后治疗肿瘤的趋势。所谓肿瘤基因治疗是指通过各种载体将治疗目的基因用基因转移技术导入肿瘤或其他体细胞内，纠正过度活化或补偿缺陷基因，从而使靶细胞获得新的特性，使其对肿瘤起杀伤和抑制作用以达到治疗肿瘤的目的。在这个过程中，通过相应的载体将目的基因导入靶细胞是关键步骤，因此，寻找一个理想的基因载体成为肿瘤基因治疗的一个重要环节。腺相关病毒（AAV）属于细小病毒科。多年来AAV由于其显著的特征成为一种很有潜力的病毒载体：1)没有发现任何人类疾病与AAV有关；2)AAV具有对分裂期细胞和非分裂期细胞都有感染的能力；3)其在体内的宿主范围比较广，如心脏，肌肉，肝脏等；另外，AAV能介导目的基因在靶细胞中长期表达。但是在AAV作为载体使用时，由于其宿主广而引起非特异的感染以及对携带的目的基因非特异的表达会引起脱靶甚至免疫反应，使其在基因治疗中受到了限制。因此提高AAV的靶向性和感染性是更好发挥AAV载体功能的关键。AAV的靶向性是由AAV衣壳决定的，AAV衣壳上含有入侵靶细胞时产生免疫反应的抗原决定簇，且衣壳是AAV侵入细胞时与宿主表面直接接触的位点，因此通过适当的方法改变AAV衣壳能获得对靶细胞有高效靶向感染性的新型AAV。目前已经发现超过100多种的AAV血清型，这些不同血清型AAV有很高的同源性，其中对AAV2的研究最为彻底。基于这个原因，本课题是以实验室保存的原始型AAV2/1、AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9为基础，以AAV2rep基因为通用rep基因，为后面设计通用引物提供基础。本课题利用DNA shuffling技术对AAV衣壳序列进行改组，构建嵌合AAV病毒文库，然后用其靶向筛选鼻咽癌细胞。其具体步骤如下：（1）构建pAdB-rc载体分子克隆文库先通过巢式PCR得到的AAV衣壳基因，即cap序列片段，将其割胶回收。再用DNase Ⅰ进行酶切，割胶回收200-1000bp片段。然后将酶切片段用各种酶进行无引物PCR重组，再用带酶切位点的引物在各种酶条件下对重组序列进行PCR扩增得到大量的嵌合型cap序列片段。通过对比各种条件下的DNA shuffling结果，筛选出最好的DNA shuffling条件，再反复使用最优条件重复DNA shuffling来扩增嵌合型cap序列片段。接着将获得的嵌合型cap序列和实验室保存的pAdBⅡ载体通过酶切连接在一起构建pAdB-rc载体，将其转化到SURE菌感受态中构建pAdB-rc载体分子克隆文库。（2）嵌合AAV的筛选在克隆库的基础上，摇菌抽提质粒，用磷酸钙转染法在HEK293细胞中包装病毒，获得嵌合AAV病毒文库。然后将得到的嵌合型AAV浓缩，测滴度，并按一定MOI值加入到鼻咽癌细胞CNE-3中。通过四轮的筛选，得到靶向感染CNE-3细胞的嵌合型AAV。（3）嵌合AAV靶向性和感染性的检测将嵌合型AAV通过PCR分离出来，酶切连接回pAdB载体中，测序，通过分析测序结果，选择比例高的克隆，命名为cAAV。得到cAAV后，我们将其与带有EGFP基因的pAAV通过双质粒磷酸钙转染法在HEK293中包装成重组AAV，命名为cAAV-EGFP。并且将各种原始型AAV也与pAAV同样包装重组成AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV3-EGFP、AAV4-EGFP、AAV7-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP。再将这8种重组AAV分别感染CNE-3细胞，通过观察绿色荧光的表达，验证cAAV-EGFP对CNE-3细胞的感染性。同时，将8种重组AAV感染其他癌细胞，以此观察其感染效率，验证cAAV-EGFP对CNE-3细胞具有靶向性。本研究通过对DNA shuffling多方面的探索，发现用Pfu DNA聚合酶进行无引物PCR重组后，再用KOD-Plus-DNA聚合酶进行扩增，得到的结果最好。然后通过磷酸钙法进行病毒包装初步得到嵌合型AAV病毒文库，并用其靶向筛选CNE-3鼻咽癌细胞。通过四轮的筛选，初步得到了嵌合型AAV（cAAV）。由测序结果得到，cAAV是由AAV1、AAV2、AAV3、AAV8组成的嵌合体。最后本研究通过对cAAV感染性和靶向性的检测，发现与原始型相比较，嵌合型对CNE-3细胞的感染效率更高，以及对CNE-3细胞的靶向性比较专一。这为cAAV在体内的进一步研究打下基础，同时也为合理构建AAV嵌合文库以及靶向筛选治疗基因做出了基础性的探索。