随着社会逐渐进步,人们的生活节奏不断加快,机体所承受的生理和心理性应激复杂和强烈程度不断增加。长期慢性应激可以打乱机体内环境,在许多疾病的发生过程中起重要作用。目前,慢性应激被认为是人类许多重大疾病的重要病因和诱因之一,约75%-90%的疾病发生与应激机制的激活有关。长期以来,代谢紊乱和代谢性疾病的发生归结于器官功能的失代偿和神经内分泌的共同结果,但近年来的研究表明,它们的发生发展与应激机制有着密切关系。但应激在脂代谢性疾病如非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的作用及具体机制尚不是非常明确。叉头蛋白O(Fork head box 0, FoxO)家族在介导胰岛素和胰岛素样生长因子通路参与细胞分化,凋亡和机体能量代谢中有至关重要的作用。通常认为,FoxO蛋白作为胰岛素代谢通路上的重要分子,对调控机体血糖的平衡有重要作用。近年来,许多研究发现,FoxO蛋白不仅在糖代谢中起作用,同时也参与了脂质代谢的调控,可能是联系2型糖尿病和脂代谢紊乱的关键分子,但关于在应激致脂代谢紊乱过程中FoxO蛋白的变化及作用仍未见研究报导。研究目的研究应激在脂代谢紊乱如NAFLD发生发展中的作用并进一步探究肝脏中FoxO蛋白在应激致肝脏脂质代谢紊乱中的调控作用。研究方法用足底电刺激和束缚应激构建小鼠慢性应激模型,通过检测小鼠肝脏内的甘油三酯含量和病理切片(HE染色和油红O染色)来评定小鼠是否发生NAFLD;利用高通量检测技术对小鼠腹内脂肪组织、血清及肝脏炎性因子进行检测；用实时荧光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测肝脏脂质代谢相关基因,肝脏内FoxO蛋白含量及上游通路变化；用FoxO6肝脏内特异性高表达C57/b16小鼠及尾静脉注射FoxO6腺病毒使之在体内高表达Foxo6的C57/b16小鼠观察血清胆固醇含量变化；利用RT-PCR技术筛选胆固醇代谢相关基因表达量情况；用FoxO6腺病毒转染小鼠肝原代细胞,观察FoxO6对LDLR基因的调控作用,并用荧光素酶报告系统及染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, Chip)来进一步探究其调控方式。研究结果1.慢性应激可导致小鼠摄食量及体重增加量减少。应激后12周内,小鼠摄食量和体重无明显增加,而对照组则稳定增加。应激12周后,应激组小鼠体重及摄食量较对照组显著减少。2.慢性应激组小鼠腹部脂肪含量较对照组显著降低,HE染色结果显示,应激组脂肪细胞较对照组显著减小,血清中游离脂肪酸显著高于对照组。慢性应激小鼠脂肪IL-6和IL-1β较对照组显著增高,而TNF-α和IL-18无明显变化,使炎症细胞聚集的趋化因子MIP-2、MCP-1和PAI-1血清含量也同样显著升高。3.慢性应激小鼠的肝指数(HI,肝脏重量/体重×100)升高。血清中的TC和TG均有升高趋势但无统计学意义,而肝脏中TG, TC含量显著升高。肝脏HE染色显示,慢性应激组有明显的脂滴沉积,肝细胞胞质疏松,呈气球样变,炎性灶增加。慢性应激组肝脏油红O染色切片有大量微泡性脂滴沉积。4.慢性应激小鼠的血清ALT和AST水平显著升高,并且NAFLD活动性炎性评分也高于对照组。ELISA结果显示,IL-6和TNF-α在血清中和肝脏中含量均升高；IL-1β和MCP-1血清含量升高,肝脏含量不变；IL-18均无明显变化。5. 慢性应激小鼠肝脏内与TG合成相关基因Fasn、SCD1表达量显著升高,而其他基因如ACC1、ELOVL6、MTTP、ApoB等均无明显变化。6.12周慢性应激小鼠的FoxO1 mRNA和蛋白在肝脏中的表达量均较对照组小鼠显著增加；FoxO1在小鼠肝脏细胞核内蛋白量较对照组增加；肝脏内胰岛素受体2(IRS2)mRNA表达量显著降低,同时其下游的p-Akt/Akt相对减少。7.肝脏内特异性高表达FoxO6转基因小鼠(FoxO6-tg)同对照组野生型小鼠对比,肝脏内FoxO6基因表达水平升高了三倍,FoxO6蛋白表达量升高了两倍。FoxO6-tg小鼠体重与野生型小鼠相比,无明显变化,但血清中胆固醇水平显著升高,呈现出高胆固醇血症状态。8. Fox06转基因小鼠肝脏内LDL受体(LDLR)勺表达量较野生型小鼠了约50%-60%,蛋白表达水平同mRNA表达趋势一致,较野生型小鼠显著降低。野生型小鼠尾静脉注射FoxO6病毒后检测其肝脏LDLR基因及蛋白表达量变化,结果与FoxO6转基因小鼠一致。Fox06病毒转染入肝原代细胞,观察LDLR表达量的变化。结果显示,FoxO6病毒转染组较空白病毒转染组LDLR的基因及蛋白表达量均明显降低。LDLR的已知转录调控因子SREBP2和其转录后调控因子PCSK9的基因表达量均没有明显变化。9.我们设计了含有SRE序列的LDLR启动子荧光素酶报告质粒,利用HepG2细胞系,通过转染SREBP2质粒及FoxO6病毒来观察FoxO6对LDLR的调控作用。结果显示,SREBP2可显著上调HepG2细胞内LDLR的表达,而这种上调作用在加入FoxO6病毒后减弱,并与FoxO6病毒浓度呈剂量依赖效应。染色质免疫沉淀实验(ChIP assay)显示,在加入FoxO6病毒后,SREBP2与LDLR启动子区的结合DNA扩增条带较空白病毒组显著减弱。研究结论1.慢性应激可导致小鼠NAFLD的发生；这种作用可能是通过增加肝脏内甘油三酯合成,促进脂肪组织分解,增加机体炎症反应来介导的,IRS2-Akt-FoxO1通路可能在其中起重要作用；2. FoxO6可通过减少SREBP2与LDLR启动子区的结合来降低LDLR的表达,导致血液中胆固醇不能被内吞入肝脏代谢,形成高甘油三酯血症。全文小结本文通过研究FoxO蛋白在应激致非酒精性脂肪肝(NAFLD)及高胆固醇血症中的作用,发现了FoxO蛋白作为转录因子,可能通过调控甘油三酯合成相关基因及肝脏摄取胆固醇的受体表达量来导致NAFLD及高胆固醇血症的发生,在脂质代谢紊乱中起重要调控作用。FoxO蛋白作为胰岛素的下游通路蛋白,可能是联系胰岛素抵抗和脂代谢紊乱的关键分子。FoxO蛋白可能成为临床防治脂质代谢紊乱的新靶点。