SUMO1修饰稳定TET3蛋白增加结直肠癌放疗敏感性的研究

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hensun01
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目的:主动DNA去甲基化酶TET家族介导的主动DNA去甲基化途径是否参与以及如何调控肿瘤放疗敏感性知之甚少。本研究致力于探究主动DNA去甲基化酶在结直肠癌辐射增敏中的作用及作用机制。以期阐明主动DNA去甲基化介导辐射增敏的新机制。方法:1.检测电离辐射和CPT处理结直肠癌细胞后TET酶家族成员(TET1、TET2、TET3)蛋白水平和mRNA表达。2.检测5种不同结直肠癌相关细胞系TET3表达与细胞辐射敏感性的关系。3.分析TCGA数据库中TET3在肿瘤组织中的表达及TET3表达与结直肠癌病理分级、临床预后的关系。4.分别构建TET3过表达HCT-8细胞系和TET3过表达HT-29细胞系,检测外源过表达TET3的结直肠癌细胞在辐射诱导后的细胞凋亡水平、细胞周期、DNA损伤程度、克隆形成率及ROS水平。5.siRNA技术分别构建TET3敲降的HCT 116细胞系和TET3敲降的LS 180细胞系,检测外源敲降TET3的结直肠癌细胞在辐射后的细胞凋亡水平、细胞周期、DNA损伤程度和克隆形成率。6.采用慢病毒构建稳定过表达TET3的HCT-8细胞系并构建了皮下移植瘤模型。局部15 Gy照射后,监测肿瘤生长。7.免疫荧光和细胞质细胞胞核蛋白检测TET3与SUMO1,SUMO2/3的共定位,CoIP实验检测TET3是否可被SUMO1,SUMO2/3修饰。8.构建 3 个截短突变质粒 3 ×FLAG-TET3-1#、3×FLAG-TET3-2#、3×FLAG-TET3-3#,和潜在SUMO化修饰位点突变质粒3×FLAG-TET3m,分别进行突变后CoIP实验。9.免疫荧光和细胞质细胞胞核蛋白检测TET3野生型和TET3m突变体的亚细胞定位和蛋白稳定性。10.检测TET3的SUMO1修饰增加或缺失的结直肠癌细胞在辐射后的DNA损伤程度,细胞凋亡水平,细胞周期分布。结果:1.TET3蛋白在结直肠癌细胞电离辐射处理后响应性增加,而mRNA没有变化;TET1、TET2蛋白和mRNA无显著变化。2.结直肠癌细胞系中TET3蛋白和mRNA表达与其恶性表型和辐射敏感性呈正相关。3.TET3在23/27种肿瘤组织中显著高表达,包括结直肠癌。TET3与结直肠癌的病理恶性分级呈正相关。结肠癌患者中高TET3表达者的无病间隔(DFI)明显缩短4.在结直肠癌细胞系中,外源过表达TET3增加了辐射诱导的细胞凋亡,G2/M期阻滞,DNA损伤及克隆抑制。5.在结直肠癌细胞系中,siRNA敲降TET3减少了辐射诱导的细胞凋亡,G2/M期阻滞,DNA损伤及克隆抑制。6.过表达TET3的结直肠肿瘤辐射后肿瘤体积、重量均受到显著抑制。7.TET3可被SUMO1和SUMO2/3修饰。并且,辐射只增加TET3的SUMO1修饰水平。8.TET3-2#,TET3-3#可被 SUMO1 修饰。只有 TET3-3#检测到 SUMO2/3 的修饰。TET3蛋白上6个潜在的SUMO化修饰位点突变体TET3m导致TET3的SUMO1修饰不再发生,而不影响TET3的SUMO2/3修饰。9.外源TET3野生型和TET3m均表达和定位于结直肠肿瘤细胞核中。TET3m相比TET3野生型蛋白半衰期明显缩短。10.过表达SUMO1进一步增加TET3野生型促进的辐射诱导后γH2AX和53BP1灶累积,细胞凋亡,G2/M期阻滞;而TET3m失去了这一效应。结论:1.TET3是结直肠癌细胞中响应辐射的关键主动DNA去甲基化酶。2.TET3在结直肠癌细胞中具有潜在的辐射增敏作用。3.TET3与结直肠癌病理分级及不良预后呈正相关,TET3可作为潜在的结直肠癌预后预测因子。4.体外过表达TET3增加了结直肠癌细胞的放射敏感性。5.体外敲降TET3减弱了结直肠癌细胞的放射敏感性。6.过表达TET3增加体内结直肠癌的放射敏感性。7.TET3是SUMO1和SUMO2/3的靶蛋白;辐射只增加TET3的SUMO1修饰。8.TET3 中 K479,K758,K1012,K1188,K1397,K1623 位点是 TET3 发生 SUMO1修饰的主要位点。TET3被SUMO2/3修饰位于833-1795 AA之间除K1012,K1188,K1397,K1623以外的其他位点。9.TET3的SUMO化修饰增加TET3蛋白的稳定性,不改变其核定位。10.TET3的SUMO1修饰是其介导结直肠癌细胞放射增敏的重要机制。
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