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大气细颗粒物质(Particulate Matter,PM)对公众健康的影响已成为全世界关注的焦点,特别是在发展中国家。最初,强调了细颗粒物对呼吸系统疾病和心血管疾病的影响。然而,不断增加的流行病学研究表明身体中的每个器官系统都可能参与其中,肾脏也不例外。已经发现,空气动力学直径小于10μm的PM(例如PM2.5)对人类健康具有更大的影响。据流行病学调查显示,全球范围内慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)的患病率持续上升,全球患病率约为10%,中国成年CKD患者患病率为10.8%,而在郑州市城区患病率高达13.57%,其防治工作已成为世界范围内所面临的重要公共卫生问题。大量证据表明,心血管疾病、高血压、糖尿病的存在可预测CKD向终末期肾脏病(End Stage Renal Disease,ESRD)的快速进展,而越来越多的证据表明空气污染也可能是CKD的一个新的风险因素,此外已有研究报告称长期暴露于高浓度的PM2.5可能与膜性肾病(Membranous Nephropathy,MN)等足细胞病的发病风险增高相关。肾脏作为血液滤过、排出毒素的重要器官,极易受到血液中空气污染物的影响,因此PM2.5暴露对肾脏疾病的影响不可忽视。在中国大气 PM2.5 中多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)含量普遍高于国外。有报道称郑州市大气PM2.5有机成分中PAHs含量最大的为苯并荧蒽(Benzo[b]fluoranthene,BbF)。我们团队的前期研究发现:IMN患者血液中PM2.5主成分BbF含量显著升高,推测BbF参与IMN的发生发展过程。自噬是一种细胞内降解系统,通过将细胞质成分传递给溶酶体保持机体内环境稳态。自噬是由一种叫做自噬体的独特细胞器介导的。足细胞中自噬体形成障碍会导致足细胞功能受损和肾小球疾病。据报道,自噬可能在苯并[a]芘(一种常见的多环芳烃化合物)诱导的细胞毒性中起着重要作用。而作为PAHs的主要毒性最强的组分BbF,其对小鼠肾小球足细胞的自噬损伤作用尚不清楚。细胞焦亡是近年来新发现的一种细胞炎症性死亡的特殊方式。细胞焦亡受多种因素影响,自噬是其中一种重要机制。而且在肾脏疾病中细胞自噬的抑制往往和细胞焦亡发生有关。据此我们假设:BbF由肺部进入体内,通过血液循环进入肾脏,抑制足细胞自噬,诱导NLRP3炎症小体活化和足细胞损伤。本研究拟从细胞水平,采用细胞分子生物学技术观察不同浓度、剂量和染毒时间BbF对肾脏足细胞自噬及NLRP3炎症小体活化的影响,探讨足细胞自噬在BbF导致足细胞损伤发生的分子机制,为其防治提供新思路。方法本研究选取永生化小鼠足细胞系(Conditionally Immortalized Mouse Podocyte,MPC)作为研究对象。1.CCK-8 比色法测定不同浓度(0μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)及不同时间(0h,6h,12h,24h,48h,72h,96h)条件下BbF染毒对MPC生存活力的影响。2.不同浓度(0μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml)及不同时间BbF(0h,24h,48h,72h)体外染毒后足细胞损伤情况:在光学显微镜下观察足细胞形态变化,通过免疫荧光观察细胞骨架蛋白F-actin及Synaptopodin变化,通过蛋白质印迹分析观察足细胞标记蛋白Nephrin和Podocin及损伤蛋白Desmin表达变化。3.不同浓度(0g/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml)及不同时间BbF(0h,24h,48h,72h)体外染毒后足细胞自噬情况:在高倍透射电镜下观察足细胞自噬小体,通过蛋白质印迹分析及免疫荧光观察自噬相关蛋白LC3B和Beclinl表达变化。4.自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)及自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)对足细胞损伤及自噬的作用:将足细胞分为Control组、BbF 组、CQ 组、BbF+CQ 组、Rapamycin 组、BbF+Rapamycin 组:通过免疫荧光观察细胞骨架蛋白Synaptopodin变化,在高倍透射电镜下观察足细胞自噬小体,通过蛋白质印迹分析观察足细胞标记蛋白Nephrin及自噬相关蛋白LC3B和Beclinl表达变化。5.不同浓度(0μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml)体外染毒后足细胞NLRP3小体活化情况:Western Blot观察不同组别足细胞NLRP3炎症小体活化后相关指标(NLRP3及caspase-1)的表达情况,探究NLRP3炎症小体在足细胞损伤中的作用。结果1.CCK-8结果表明,苯丙荧蒽以时间及剂量依赖性显著抑制足细胞生存活力(P<0.05)。2.光镜结果显示,随着苯丙荧蒽染毒浓度增大及染毒时间延长,足细胞形态改变。细胞免疫荧光结果显示,随着染毒浓度增大及染毒时间延长,足细胞内细胞骨架蛋白表达强度逐渐减弱。蛋白质印记分析结果显示随着染毒浓度增大及染毒时间延长,足细胞损伤情况越严重,Synaptopodin、Nephrin、Podocin表达逐渐减少,Desmin表达逐渐增加,表明肾脏损伤随浓度升高及时间延长加重(P<0.05)。3.蛋白质印记分析结果显示随着苯丙荧蒽染毒浓度增大及染毒时间延长,自噬相关蛋白Beclinl、LC3B的表达减少,并且与足细胞损伤蛋白Nephrin表达呈正相关。透射电镜结果显示随着染毒浓度增大及染毒时间延长,足细胞内自噬小体数目随染毒剂量增加而减少,表明自噬水平随浓度升高及时间延长而减弱(P<0.05)。4.蛋白质印记分析及免疫荧光结果显示CQ干预下BbF致足细胞自噬减轻,足细胞损伤加重。Rapamycin干预下BbF致自噬加重,足细胞损伤减轻。5.蛋白质印记分析结果显示随着BbF染毒浓度的增加,NLRP3炎症小体活化后相关指标(NLRP3及caspase-1),表明BbF致足细胞损伤可能与NLRP3炎症小体活化相关。结论1.大气细颗粒物中有机成分苯并荧蒽对足细胞造成损伤,且损伤程度随着苯丙荧蒽染毒浓度增大及染毒时间延长加重。2.自噬抑制和NLRP3炎症小体活化是苯并荧蒽引起足细胞损伤导致肾脏疾病发生的可能机制,仍需进一步深入探索。