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蛋白质是重要生物大分子物质，参与细胞组成结构或重要生理活动。为了研究蛋白质的结构和功能，为了将蛋白质应用于生物医药、工农业生产等领域，都需要获得足量的、高纯度的蛋白质。通过基因工程技术是获得目标蛋白质的重要途径。尽管蛋白的重组表达与纯化体系和方法已相对成熟，也得到了广泛应用，但也存在许多需要面对的问题，主要问题是蛋白质纯化周期长、操作复杂、材料费用高、包涵体表达等问题。为了解决这些问题，本论文以细菌菌体为材料制备细菌增强基质(Bacterial enhancer matrix，BEM)，结合以能够锚定到细胞壁肽聚糖的乳酸乳球菌肽聚糖水解酶AcmA的C端结合域为基础的AcmA表达系统，建立了一种新型蛋白纯化与固定化方法。主要结果如下：
选取革兰氏阳性和革兰氏阴性野生菌株及标准菌株共14株，用0.1MHCl煮沸处理，得到以肽聚糖为主要成分的细胞壁组分，命名为BEM。用扫描电镜(SEM)观察，发现BEM保持了细菌细胞原有的形态。
为了构建与BEM相适应的重组蛋白表达系统，以pET系列质粒为基础，添加AcmA标签及6×GlyLinker得到具有不同抗性的质粒pET-28a-AcmA、pET-32a-AcmA；为了便于AcmA表达系统的广泛应用，进一步丰富了多克隆位点区的酶切位点，得到了质粒pET-28a-Z-AcmA、pET-32a-Z-AcmA；为了便于AcmA标签的去除，添加了凝血酶位点，得到了质粒pET-28a-Z-Th-AcmA、pET-32a-Z-Th-AcmA。
采用上述构建的含AcmA基因的质粒克隆α淀粉酶和脂肪酶基因，并进行表达，应用14种不同细菌的细胞壁制备BEM，对其纯化和固定化重组蛋白的可行性进行测试。以研究较多的乳酸乳球菌NZ9000制备的BEM结合力按100%计，其他细菌制备的BEM表现出不同的结合能力，对α淀粉酶和脂肪酶的最低结合力分别为75%和70%，纯化固定化过程在2h内完成。活的革兰氏阳性菌细胞具有结合AcmA标签的能力，而活的革兰氏阴性菌不具有结合能力。
用含有AcmA基因标签的质粒构建α淀粉酶和脂肪酶基因重组质粒，并进行表达，测试BEM纯化固定化效果。诱导表达并经超声破碎后离心的上清，与BEM室温下混匀结合30min，离心分离，测试BEM纯化固定化效果。结果表明，与BEM的结合不影响重组酶的活性，经过8轮催化反应后，BEM固定化α淀粉酶的酶活回收率超过35%，固定化蛋白达60%；经9轮反应后，BEM固定化脂肪酶的酶活保持在60%，固定化蛋白保持在90%。在AcmA标签和目的蛋白之间添加凝血酶位点，重组蛋白纯化后经凝血酶切割后得到无标签蛋白。用含有AcmA基因标签的质粒构建漆酶基因重组质粒，在大肠杆菌中进行表达，以重组大肠杆菌细胞和表达后超声破碎离心沉淀分别制备BEM，两种BEM的纯化固定化率均超过85%。
利用本论文构建的实验技术对重组α淀粉酶包涵体的纯化固定化效果进行的研究。变性剂对BEM具有溶解能力，对革兰氏阳性菌制备BEM具有接近60%的溶解能力，对革兰氏阴性菌制备的BEM具有超过80%的溶解能力。变性剂对BEM的溶解是浓度依赖型。利用8M尿素溶解包涵体，BEM与包涵体的尿素溶液室温下结合1h，大部分目的蛋白通过特异性结合被纯化固定化。
利用本论文构建的实验技术对大肠杆菌重组蛋白表达系统中内毒素的去除效果进行了研究。将具有抗肿瘤作用的L-天门冬酰胺酶的基因进行克隆，表达后用乳酸乳球菌NZ9000制备的BEM进行纯化固定化，经8轮回收酶后活性为35%，蛋白含量大于90%。然后用1%的TritonX-114在4℃条件下进行固液分离，内毒素去除率达99.99%。本方法实现了在低温条件下内毒素的去除。
综上所述，本论文建立了一种新的重组蛋白的纯化固定化方法，利用细菌菌体制备纯化固定化材料BEM，纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白。该方法材料廉价、操作简便、快速高效、应用面广，为重组蛋白的纯化与固定化提供了新的选择，具有广阔的应用前景。
选取革兰氏阳性和革兰氏阴性野生菌株及标准菌株共14株，用0.1MHCl煮沸处理，得到以肽聚糖为主要成分的细胞壁组分，命名为BEM。用扫描电镜(SEM)观察，发现BEM保持了细菌细胞原有的形态。
为了构建与BEM相适应的重组蛋白表达系统，以pET系列质粒为基础，添加AcmA标签及6×GlyLinker得到具有不同抗性的质粒pET-28a-AcmA、pET-32a-AcmA；为了便于AcmA表达系统的广泛应用，进一步丰富了多克隆位点区的酶切位点，得到了质粒pET-28a-Z-AcmA、pET-32a-Z-AcmA；为了便于AcmA标签的去除，添加了凝血酶位点，得到了质粒pET-28a-Z-Th-AcmA、pET-32a-Z-Th-AcmA。
采用上述构建的含AcmA基因的质粒克隆α淀粉酶和脂肪酶基因，并进行表达，应用14种不同细菌的细胞壁制备BEM，对其纯化和固定化重组蛋白的可行性进行测试。以研究较多的乳酸乳球菌NZ9000制备的BEM结合力按100%计，其他细菌制备的BEM表现出不同的结合能力，对α淀粉酶和脂肪酶的最低结合力分别为75%和70%，纯化固定化过程在2h内完成。活的革兰氏阳性菌细胞具有结合AcmA标签的能力，而活的革兰氏阴性菌不具有结合能力。
用含有AcmA基因标签的质粒构建α淀粉酶和脂肪酶基因重组质粒，并进行表达，测试BEM纯化固定化效果。诱导表达并经超声破碎后离心的上清，与BEM室温下混匀结合30min，离心分离，测试BEM纯化固定化效果。结果表明，与BEM的结合不影响重组酶的活性，经过8轮催化反应后，BEM固定化α淀粉酶的酶活回收率超过35%，固定化蛋白达60%；经9轮反应后，BEM固定化脂肪酶的酶活保持在60%，固定化蛋白保持在90%。在AcmA标签和目的蛋白之间添加凝血酶位点，重组蛋白纯化后经凝血酶切割后得到无标签蛋白。用含有AcmA基因标签的质粒构建漆酶基因重组质粒，在大肠杆菌中进行表达，以重组大肠杆菌细胞和表达后超声破碎离心沉淀分别制备BEM，两种BEM的纯化固定化率均超过85%。
利用本论文构建的实验技术对重组α淀粉酶包涵体的纯化固定化效果进行的研究。变性剂对BEM具有溶解能力，对革兰氏阳性菌制备BEM具有接近60%的溶解能力，对革兰氏阴性菌制备的BEM具有超过80%的溶解能力。变性剂对BEM的溶解是浓度依赖型。利用8M尿素溶解包涵体，BEM与包涵体的尿素溶液室温下结合1h，大部分目的蛋白通过特异性结合被纯化固定化。
利用本论文构建的实验技术对大肠杆菌重组蛋白表达系统中内毒素的去除效果进行了研究。将具有抗肿瘤作用的L-天门冬酰胺酶的基因进行克隆，表达后用乳酸乳球菌NZ9000制备的BEM进行纯化固定化，经8轮回收酶后活性为35%，蛋白含量大于90%。然后用1%的TritonX-114在4℃条件下进行固液分离，内毒素去除率达99.99%。本方法实现了在低温条件下内毒素的去除。
综上所述，本论文建立了一种新的重组蛋白的纯化固定化方法，利用细菌菌体制备纯化固定化材料BEM，纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白。该方法材料廉价、操作简便、快速高效、应用面广，为重组蛋白的纯化与固定化提供了新的选择，具有广阔的应用前景。