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天花粉蛋白(trichosanthin，Tk)这一植物蛋白由我国学者最早分离，并后围绕其特性和生物学功能进行了大量的多学科研究。在临床应用方面发现，天花粉蛋白除了引产和破坏滋养层细胞外，还能够抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤凋亡、以天然形式或与单抗构成免疫毒素可以特异地杀伤肿瘤细胞，并抑制HIV病毒、乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒以及其他一些致病性病毒复制、增殖。近年来，有关免疫抑制机制的研究取得了一定的进展，发现Tk所诱导的免疫抑制与MHC背景密切相关，可通过下调APC IL-12的分泌和表面CD80分子的表达参与免疫抑制等。为进一步了解其免疫抑制的机制及可能的应用，本文从以下四个方面进行了研究：
一、天花粉蛋白对不同小鼠品系T细胞亚群分化的影响
为进一步探讨不同品系小鼠对天花粉蛋白(Tk)免疫抑制敏感性不同的机制，明确抑制过程中T细胞亚群的分化、T细胞亚群的特点、相关细胞因子及转录因子的基因表达等特点，我们选择Tk高敏感品系(C257BL／6)和低敏感品系(C3H／He)小鼠，建立OVA特异性体外增殖系统，应用流式细胞术胞内细胞因子染色技术分析Th和Tc细胞亚群，real-time PCR检测细胞因子及相关转录因子的mRNA水平。发现Tk作用下，高敏感品系小鼠C57BL/6 IL-4阳性T细胞明显增多，表达IFN-γ阳性T细胞则显著减少。而低敏感品系C3H／He相关变化不明显。T细胞分化相关细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ及转录因子T-bet、gata一3的基因表达水平也呈现类似的格局。提示Tk发挥免疫抑制作用可能与其主要诱导Th2／Tc2亚群有关，且这种诱导特定T细胞亚群的作用在小鼠中和H-2。基因型相关。
二、天花粉蛋白免疫抑制作用的功能性肽段筛选
尽管许多研究表明天花粉蛋白具有引产、抑癌、抑制HIV复制、诱发免疫抑制等重要的生物学功能，但作为一种用于临床的药物，存在一个重要的问题，就是其具有较强的毒副作用，会引起发烧、肌肉酸痛、关节痛和头痛等不适症状。这些副作用限制了天花粉蛋白在临床上应用。我们依据T细胞抗原表位的原理设想能否通过合成全蛋白的各种重叠肽段，从中筛选出既保留免疫抑制功能又避免毒副作用的肽段，使之发展成为一种高效低毒的免疫制剂用于临床。实验成功筛选到几条具有免疫抑制功能的Tk衍生肽。并选取对Tk抑制作用的高敏感品系小鼠C57BL/6和低敏感品系小鼠C3H/He，同时观察了肽段的抑制作用在两个品系间的差异，发现具有抑制作用的PE和PS肽段在两个品系间未显示明显差别，而PQ、PB及PJ与Tk全分子一样，两个品系小鼠的敏感性不同，表明诱发的免疫应答与小鼠的遗传背景密切相关。Tk衍生肽段也影响了OVA特异性增殖系统中细胞因子分泌的格局，使得原来以Thl/Tcl分泌的细胞因子为主状态向Th2/Tc2偏移。表现为IL-4和IL-10分泌增加，而IFN-γ分泌减少。值得注意是如果剔除了CD8<’+>T细胞，可以在一定程度上解除天花粉蛋白及其肽段的抑制作用，表明其发挥作用可能是CD8<’+>T细胞介导。这个结果为进一步阐明Tk及其衍生肽免疫抑制和基因调控的确切机制提供新的研究模型。
三、 天花粉蛋白及其衍生肽段的抑制作用依赖APC表面Notch配体的表达
新近的研究发现，在免疫系统中，Notch信号途径不仅调控T/B细胞谱系的产生还参与调节外周成熟T细胞及其亚群的分化和功能的发挥。前期研究结果均表明了CD8<’+>T细胞以及APC在天花粉蛋白发挥免疫抑制作用中起着非常重要的作用，但这两群细胞之间存在什么样的关系目前尚不清楚。是不是可以通过影响Notch分子的表达来诱导这群CD8<’+>T细胞。实验发现未成熟DC(iBMDC)不表达或极低表达Notch分子的5种配体，经LPS处理诱导成熟后除配体中的Delta 3
外，其余配体的表达均有所上调。但如果同时加入LPS与天花粉蛋白或其衍生肽段后，另一配体Jaggedl分子的表达较BMDC有明显的增加，Deltal也有一定程度的增加，其他配体的表达未见有明显改变。经天花粉蛋白或其衍生肽段处理后的DC可以改变纯化的CD8<+>T细胞增殖的细胞因子分泌格局，明显抑制I类细胞因子IFN-γ的分泌，而Ⅱ类细胞因子IL-4、IL-10分泌明显增加。过继转移试验证明这种CD8<+>T细胞可以抑制抗原特异的增殖反应，说明这是一群具有抑制功能的CD8<+>T细胞。Notch信号的阻断剂可以部分逆转Tk及肽段的抑制作用，说明该信号途径可能参与诱导产生了这群CD8<+>T细胞。四、 天花粉蛋白衍生肽用于胶原诱导的小鼠关节炎治疗的
实验研究
前面实验中已通过体外实验确认，天花粉蛋白的某些衍生肽与全蛋白一样具有较强的免疫抑制能力，并且分析其机制可能在于抑制Thl型的细胞及其产生的细胞因子，诱导出以Tc2为主的Ⅱ类细胞因子分泌格局，正因为这种能够促进细胞分泌格局向Ⅱ类偏移的能力，使得其除了作为研究机体T细胞分化的一种较好的模型用于基础研究以外，在临床应用方面也应具有非常重要的前景。本实验探讨了天花粉蛋白及其衍生肽段对Thl型的自身免疫性疾病模型的治疗作用，将牛II型胶原与佐剂乳化后，免疫CIA(collagen-induced arthritis)易感品系小鼠DBA／1J，诱导其产生关节炎，然后通过腹腔注射天花粉蛋白或其衍生肽段进行治疗，观察其治疗效果。本实验结果表明大剂量的衍生肽段可以抑制或延缓关节炎的发生，减轻CIA小鼠关节受损程度。天花粉全蛋白及低剂量的肽段未能发挥此作用，尽管它们在一定程度上也降低了CIA小鼠脾细胞的增殖能力。总之，本实验证实我们筛选到的具有免疫抑制能力的天花粉蛋白肽段在体内也具有免疫抑制功能，有望发展为一种免疫调节药物用于临床。