香味作为柑橘风味中重要的品质而备受消费者关注。萜烯类物质是柑橘中最主要的挥发性物质,不仅影响柑橘果实的香气品质,而且对果实抗病虫害等都有重要作用。近年来柑橘果实中挥发性物质代谢研究成为热点,但大多缺乏系统性。柑橘种质资源丰富,不同种类柑橘资源香气品质有较大差异,为柑橘香气品质研究提供了丰富多样的材料。因此,从代谢和分子水平对柑橘种质进行大规模资源评价以及香味形成相关基因的挖掘和验证,对特殊香气资源及关键基因的发掘和利用、香味优异的果实育种及柑橘精油产业的发展具有重大意义。本研究首先对不同柑橘种质资源果皮、汁胞、叶片和花等组织进行挥发性物质代谢谱分析;其次,基于柑橘果皮挥发性物质谱,筛选不同柑橘种类间香味差异的候选标志物;然后,以红肉脐橙为材料,结合多组学数据筛选候选基因,并将STPS、Cs2g07240和Cs3g07920在原核表达或酵母体系中表达验证功能;最后,在实验室研究基础上进一步验证莽山野柑香气传递的花粉直感现象,筛选并验证Cit LO1基因功能。主要研究结果如下:1.柑橘不同种质、组织挥发性物质谱分析1.1分属7个柑橘种类108个种质果皮和汁胞中分别鉴定162和107种挥发性物质。果皮中挥发性物质总量远高于汁胞,大多数种质中主要的挥发性物质为单萜类物质。柑橘果皮中,单萜醇类物质主要在宽皮柑橘中积累;倍半萜醇、倍半萜和单萜醛主要在克里曼丁橘和宜昌橙中积累等。利用34种差异积累的挥发性物质层级聚类分析(HCA)结果与传统分类学相似度高。对不同产区或年份的同一品种分析,发现环境因素在挥发性物质代谢中起重要作用。明确了一些积累特殊挥发性成分的特异材料,可为未来育种或精油生产原材料。1.2主成分分析发现宽皮柑橘、柚、甜橙和柠檬可经两个主成分分开。偏最小二乘法分析(PLS–DA)发现30种潜在标志代谢物,对解释度较高代谢物分析发现β-榄香烯、瓦伦烯、柠檬内脂和诺卡酮分别主要在宽皮柑橘、甜橙、柠檬和柚中积累。17种化合物可用于区分克里曼丁橘、甜橙和宽皮柑橘,且均在克里曼丁橘中显著积累。利用4种VIP最高的标志代谢物(β-榄香烯、瓦伦烯、柠檬内脂和诺卡酮)对30种柑橘种质识别分类,准确率分别为93.33%、96.67%、96.67%和100%。种类间差异积累的化合物可能对不同类型柑橘的特殊香味有关。1.3分别在62柑橘种质叶片和25种质花中鉴定198和82种挥发性物质。与果皮相比,叶片中主要挥发性物质有较大差异,如枸橼中含量最高的是d-柠檬烯,宜昌橙中是trans-β-罗勒烯,酸橙中是乙酸芳樟酯等。34种广泛积累的萜烯类物质,其中31种在野生或半野生种质中含量最高。野生或半野生种质中萜烯类物质总量显著高于栽培种;叶片转录组和实时荧光定量PCR数据发现五个MVA途径基因和一个MEP途径基因(牻牛儿基焦磷酸合酶基因)在野生种中显著高于栽培种,而MEP途径中类胡萝卜素支路基因(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因)在野生种显著低于栽培种。推测柑橘驯化过程中,萜烯类物质可能存在负选择作用。完全开放花中有4种萜烯醇物质显著高于气球期花,而香桧烯显著低于气球期花。2.多组学结合分析甜橙中萜烯物质合成相关基因2.1甜橙、柚和宽皮柑橘基因组中TPS基因家族分析,发现柑橘中TPS基因为76-100个。分为TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e/f和TPS-g等5个亚家族。柚基因组中59个基因位点不均匀分布在7条染色体上,2号染色体分布最多,且2号染色体上发现一个372kb区域上有17个TPS基因的基因簇。2.2以红肉脐橙不同组织为材料,转录组和代谢组学关联分析得到9个基因表达量与多种萜烯类物质含量显著相关,且大多数TPS基因具有组织特异性表达特性,结合酵母体系证明Cs2g07240具有合成橙花叔醇的功能;Cs3g07920具有合成(E)-β-法尼烯和α-法尼烯的功能。原核表达蛋白饲喂实验证明STPS是主要合成香桧烯的单萜基因。分析不同组织中MEP、MVA途径和TPS基因表达,发现大多数基因在果皮中表达量较高及表达基因数量多、叶和花次之,汁胞中最少,可能由于基因表达量和表达数量的差异,造成果皮中萜烯类物质含量高,汁胞中含量低。3.莽山野柑特征香气的花粉直感现象验证及关键CYP450基因挖掘与功能表征分别在湖北宜昌和浙江丽水利用莽山野柑花粉对HB柚和翡翠柚进行授粉实验,检测汁胞挥发性物质发现,顺式-、反式-芳樟醇氧化物在授莽山野柑花粉组显著高于自然授粉组。结合前期授粉结果表明莽山野柑花粉直感效应影响柚种质汁胞中挥发性物质显著增加,不受地域和环境影响。利用授莽山野柑花粉华农红柚和自然授粉华农红柚转录组筛选到一个CYP450基因(Cit LO1),在烟草BY2悬浮细胞系中异源表达,添加底物(–)-芳樟醇,发现转基因Cit LO1系中顺式-、反式-芳樟醇氧化物含量是对照的3–4倍,结果显示Cit LO1基因在芳樟醇氧化物形成中具有重要的作用。综上所述,本研究基于GC–MS对不同柑橘种质、不同组织挥发性物质谱评价和分析,发掘多种挥发性物质谱特殊的优异资源,宽皮柑橘、甜橙、柠檬和柚标志代谢物分别为β-榄香烯、瓦伦烯、柠檬内脂香茅醛和诺卡酮等,挖掘并验证了4个重要萜烯类物质合成基因,为揭示柑橘香气性状形成及积累规律提供重要的材料,对进一步研究柑橘香气形成及柑橘风味提升有重要意义。