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埃博拉病毒病(Ebola virus diseases,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的一种高致病性的烈性传染病。致病性最强的扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus),致死率可高达90%。埃博拉疫情的爆发对人类产生极大的威胁,但目前仍没有上市的埃博拉疫苗。病毒载体与埃博拉病毒保护性抗原GP蛋白重组的疫苗,如重组水泡口腔炎病毒(VSV)疫苗、重组腺病毒(r ADv3,r ADv5)疫苗等在灵长类动物中以诱导有效的免疫应答走在前面,而且已完成Ⅰ期临床研究,有效解决了应急需求,但它们均以活病毒为载体,存在潜在的安全性风险,距离正式批准上市仍有一段路要走。病毒样颗粒疫苗(Virus-like particles,VLP)是一类具有病毒结构,没有病毒复制能力,较减毒疫苗和以病毒为载体的疫苗更加安全的疫苗种类。以病毒样颗粒形成的疫苗抗原可有效激发免疫应答和免疫保护效果,研发病毒样颗粒疫苗已成为埃博拉疫苗发展的重要方向。埃博拉病毒已被列为生物安全等级4级的病毒,应用埃博拉病原体的操作受到严格的限制和规定。因此阻碍了疫苗研发及其致病机制研究。而近年发展起来的假病毒系统可以模拟埃博拉病毒感染宿主过程,无病毒的致病性,可在中和抗体等多方面替代病毒的使用,在低安全级别的实验室进行操作,为埃博拉疫苗有效性评价提供了保证。目前处于Ⅰ期临床阶段的埃博拉疫苗与现上市疫苗一样,多为有针肌肉注射免疫,存在恐针感、交叉感染、断针等弊端,抗原用量大、免疫保护不全面现实问题。由此,在免疫接种策略上降低抗原用量、诱发全面免疫应答与保护及无针无痛、简便快速、安全高效已成为疫苗研发迫切解决的重大科学问题。随着近年无针注射技术的发展及应用,为发展无针皮内免疫埃博拉疫苗提供了新思路。本研究针对目前流行的扎伊尔型埃博拉病毒疫苗研发的现实需求,采用昆虫表达系统制备ZEBOLA-VLP,通过无针皮内、有针肌肉注射途径分别免疫BALB/c小鼠,并制备重组扎伊尔型埃博拉假病毒用于中和抗体测定,其研究简要报告如下:一、目的运用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达扎伊尔型埃博拉病毒GP+VP40-VLP(ZEBOLA-VLP)疫苗,经皮内、肌肉途径分别免疫小鼠,并以HIV骨架构建扎伊尔型埃博拉病毒囊膜GP蛋白的假病毒,评价免疫效果,为研发ZEBOLA-VLP疫苗提供实验依据。二、方法1、重组ZEBOLA-VLP抗原制备:首先通过Vector NTI AdvanceⅡ系统对扎伊尔型埃博拉病毒保护性抗原GP和VP40蛋白基因序列进行优化;采用基因重组构建穿梭质粒p Fast Bac DUAL-VP40-GP;将重组的ZBacmid-VP40-GP转染昆虫Sf9细胞获取重组杆粒病毒,表达重组ZEBOLA-VLP抗原;进一步超滤浓缩,蔗糖梯度离心纯化制备ZEBOLA-VLP抗原;通过SDS-PAGE、Western blot和HPLC等方法对重组ZEBOLA-VLP抗原鉴定。2、重组埃博拉假病毒系统构建:以埃博拉病毒GP基因为靶点,采用慢病毒骨架,合成埃博拉病毒表面囊膜结构基因;借助辅助载体等表达埃博拉病毒的糖蛋白GP;与HIV骨架包被,制备只能感染细胞和安全性良好的假病毒系统。为埃博拉疫苗评价提供实验基础。3、重组ZEBOLA-VLP抗原免疫效果初步评价:取制备的重组ZEBOLA-VLP抗原1μg、3μg、10μg、30μg、50μg剂量组分别无针皮内和有针肌肉免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠,间隔21日加强免疫一次,并用等量的PBS作阴性对照,于免疫前、免疫后14日采血;采用重组扎伊尔型埃博拉假病毒及间接ELISA方法分别测定免疫小鼠血清中和抗体效价和特异性Ig G抗体效价,评价重组ZEBOLA-VLP疫苗的免疫效果。三、结果成功构建扎伊尔型埃博拉p Fast Bac DUAL-VP40-GP穿梭质粒并在昆虫细胞中获得高效表达,经30%和60%蔗糖梯度离心加S600柱层析获得了95%纯度的重组ZEBOLA-VLP候选疫苗抗原。制备的ZEBOLA-VLP抗原经SDS-PAGE、Western blot鉴定有目的蛋白,电镜下观察病毒颗粒结构大小均一,HLPC测定重组ZEBOLA-VLP抗原纯度达到95%;经显微观察及假病毒滴定判定,成功包装了稳定性好、滴度高、安全的假病毒系统,可用于中和抗体效价检测;免疫重组ZEBOLA-VLP疫苗各剂量组均可诱导小鼠产生中和抗体,并存在剂量依赖关系;无针皮内免疫小鼠10μg为注射最佳剂量,其刺激产生的特异性Ig G抗体效价明显高于其他剂量组;相同剂量组比较,无针皮内免疫效果均高于肌肉注射组。四、结论1、率先在国内针对当前爆发的扎伊尔型埃博拉流行株成功研制出高纯度重组ZEBOLA-GP+VP40 VLP疫苗,为防控埃博拉提供了新疫苗类型;2、借助HIV慢病毒并针对扎伊尔型埃博拉流行株成功制备出高滴度、稳定性好、安全性高的重组埃博拉假病毒,为研发埃博拉疫苗的有效性评价提供了实验材料。3、创新研发的低压无针免疫重组ZEBOLA GP+VP40-VLP疫苗具有良好的免疫效应和安全性,且疫苗抗原用量比有针肌肉注射免疫用量少,此埃博拉疫苗类型填补了这一领域的国内外空白。