【摘 要】
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甘草作为一种药食两用植物,在许多领域都得到了广泛的应用,因此需求量极大。目前,野生甘草资源严重不足,市面上流通的多为人工种植甘草,但人工种植甘草的质量远不如野生甘草。甘草质量的评判标准是甘草酸的含量,甘草酸是甘草中主要药效成分之一,属于萜类化合物。有研究表明禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类（vmyb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB）转
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甘草作为一种药食两用植物,在许多领域都得到了广泛的应用,因此需求量极大。目前,野生甘草资源严重不足,市面上流通的多为人工种植甘草,但人工种植甘草的质量远不如野生甘草。甘草质量的评判标准是甘草酸的含量,甘草酸是甘草中主要药效成分之一,属于萜类化合物。有研究表明禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类（vmyb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB）转录因子可以调控萜类化合物的合成,但有关于甘草中MYB转录因子调控甘草酸的合成未见报道。本文以乌拉尔甘草全基因组序列为参考,借助生物信息学方法与手段对甘草中的MYB转录因子进行鉴定,基于转录组数据对不同MYB基因成员的表达调控和基因功能进行研究,同时建立甘草毛状根体系,以期为深入解析甘草酸的生物合成调控机制、改善甘草质量、缓解甘草资源紧张等问题提供借鉴。主要研究结果如下:1、通过对甘草种子分别进行直接种植、碾磨、温水浸泡和浓硫酸浸泡处理,探索甘草种子最佳处理方法;通过对甘草种植土壤（即不同粒径的蛭石与营养土的比例）、培养温度、浇水周期等进行试验,探索甘草最佳培养条件。最终确定甘草实验室种植最优方案为:种子经过浓硫酸浸泡处理40 min后,在小蛭石与营养土按照2:1混合、培养温度为26℃、光照/黑暗为16/8小时、浇水周期为5天的培养条件下生长较好。经ITS2序列比对鉴定所种植甘草品种为乌拉尔甘草。2、经MYB基因家族分析从甘草中鉴定出136个MYB基因,2R-MYB类有130个,3R-MYB和4R-MYB分别有5个和1个。编码的氨基酸等电点（p I）介于4.46～10.08,分子质量（Mw）从12.270～117.563 k Da。与拟南芥MYB氨基酸序列共同构建的进化树显示,MYB基因家族可分为38个亚组,其中亚组14只有甘草MYB蛋白。为进一步研究Gly MYB结构特征,对其氨基酸序列进行保守基序预测,结果表明大多数序列含有保守基序Motif2、Motif4和Motif8,说明它们是MYB蛋白序列的重要组成部分。共将103个MYB基因定位至scaffold上,共鉴定出18个共线Gly MYB基因对。有23对Gly MYB基因存在复制事件,基因家族主要采用片段复制方式进行扩张,且都被纯化选择。亚细胞定位分析Gly MYB蛋白均定位在细胞核中。这些结果说明Gly MYB家族基因趋异进化,也暗示该家族基因可能参与多种生理生化调控过程。3、建立了高效液相色谱（HPLC）法测定甘草中甘草酸含量的方法,发现甘草酸主要在甘草根中积累;确定出甘草根中甘草酸含量较高的Me JA处理条件为:1 m M Me JA处理12 h。对Me JA处理的甘草转录组分析发现:MYB类转录因子是主要的差异表达转录因子之一,并发现大部分MYB基因受到MeJA的调控作用;筛选出3个响应Me JA诱导表达上调的甘草酸合成途径中的关键酶基因HMGR、β-AS和FPPS;通过实时荧光定量PCR实验验证Me JA对甘草酸合成的调控作用。转录组分析结果揭示了Me JA对Gly MYB基因和甘草酸生物合成途径中部分关键酶基因的调控作用以及MYB转录因子与甘草酸生物合成途径中部分关键酶基因的表达有相关关系。4、使用ArA4农杆菌侵染甘草无菌苗根和叶组织制备的外植体,分别在MS和1/2MS培养基上进行毛状根的培养。最终本实验使用Ar A4农杆菌,以甘草无菌苗根和叶组织为外植体在1/2MS培养基上成功培养出了甘草毛状根,为进一步探索Gly MYB基因的功能及其调控次生代谢产物合成的机制奠定基础。
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