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第一部分小鼠心脏cTnI基因时序表达规律及衰老小鼠心脏形态及功能目的:心肌肌钙蛋白I(cTnI)是调控心脏舒缩功能的重要心肌纤维蛋白,其正常表达对心脏功能特别是舒张功能的维持至关重要。流行病学研究发现心脏舒张功能障碍在老年人群中较为常见,可能与老年人心脏中cTnI含量下降有关。因此本部分研究将阐明小鼠出生至衰老期cTnI基因转录表达的时序性规律,并对衰老期小鼠心脏形态及功能进行评测,为研究心脏舒张功能障碍奠定模型基础。方法:1、以近交系健康清洁级c57小鼠为研究对象,时间点分别选取NB,2w,3m,10m及18m。获取各组小鼠心脏组织进行如下检测:western blot检测cTnI与c Tn T蛋白表达水平;Q-PCR检测cTnI m RNA表达水平;2、以3m和18m小鼠为研究对象,利用高频超声检测其心脏功能:左室短轴切面测量小鼠心脏收缩功能,分别检测IVS、LVID及LVPW,计算左室EF及FS值;四腔心切面测量二尖瓣血流速度,评价E/A比值,IVRT及IVCT值;3、取3m及18m小鼠心肌组织,利用透射电镜及H&E染色分别对心肌超微结构及大体心脏形态进行观察。结果:1、3m小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA水平显著高于新NB、2w及18m;与10m间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p<0.05;10m vs.3m p>0.05)。c Tn T蛋白在各组间表达水平无显著差异(p>0.05);2、IVS、LVID、LVPW、EF及FS值在3m及18m之间小鼠之间无显著性差异(p>0.05)。而18m组小鼠IVRT较3m组小鼠显著延长,E/A比值显著降低,p<0.05;IVCT则在两组间无显著差异,p>0.05;3、3m小鼠心脏超微结构无明显异常,18m小鼠心肌细胞Z线增粗、肌丝发生溶解及水样变性、肌浆网扩大。两组小鼠心脏大体形态未见显著异常。结论:1、小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA从新生表达开始升高,3m达高峰,18m表达回落;2、衰老期小鼠存在心脏舒张功能障碍,而收缩功能无明显改变;3、衰老期小鼠心肌超微结构出现明显破坏。第二部分衰老期小鼠心脏舒张功能障碍中cTnI基因低表达的表观遗传机理目的:第一部分研究发现衰老期小鼠心脏cTnI蛋白及m RNA水平均显著降低,提示cTnI下降可能发生在其自身转录水平。DNA甲基化通过对基因Cp G岛及启动子CG位点的修饰调控基因表达,而组蛋白乙酰化通过对基因染色质的动态调控而影响基因转录。因此本部分研究从DNA甲基化及组蛋白乙酰化为切入点,探讨衰老期小鼠心脏cTnI降低的表观遗传学机理。方法:研究对象同前。获取小鼠心脏组织进行如下检测:1、利用MSP及BSP检测cTnI启动子-1500bp左右Cp G岛及cTnI启动子关键顺式作用元件GATA及Mef2元件散在CG位点DNA甲基化水平;2、利用Ch IP-PCR技术检测cTnI启动子关键顺式作用元件区域组蛋白H3、H3K9、H3K27乙酰化水平;3、采用Ch IP-PCR方法检测与cTnI关键顺式作用元件对应转录因子GATA4和Mef2c的结合水平。1、各组小鼠cTnI启动子上游Cp G岛和GATA&Mef2元件散在CG位点均存在DNA甲基化;但各组间cTnI基因Cp G岛及启动子关键元件散在CG位点DNA甲基化水平无显著差异,p>0.05;2、3m组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3及H3K9水平显著高于NB、2w及18m组;与10m组间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p<0.05;10m vs.3m p>0.05);3m组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K27乙酰化水平显著高于NB及2w,与10m及18m间对比无显著统计学差异(NB,2w vs.3m p<0.05;10m,18m vs.3m p>0.05);3、3m组小鼠心脏中GATA4和Mef2c与cTnI启动子GATA&Mef2元件结合水平显著高于NB、2w及18m组;与10m组间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p<0.05;10m vs.3m p>0.05)。结论:1、DNA甲基化可能并未参与cTnI基因时序性表达;2、衰老期小鼠心脏cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平显著降低,转录因子GATA4及Mef2c与之结合水平亦降低,提示cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3乙酰化可能参与调控cTnI时序性表达。结果:第三部分EGCG上调cTnI基因表达改善衰老期小鼠心脏舒张功能目的:第二部分研究发现cTnI启动子区域组蛋白低乙酰化可能是引起衰老期小鼠cTnI低表达的机理之一,近期研究发现EGCG(儿茶素)能上调组蛋白H3K9乙酰化水平,因此本部分实验选择EGCG作为干预剂,明确体内水平EGCG干预对老年小鼠心脏cTnI表达及心脏舒张功能的影响,并探讨其内在机理。方法:以16m老年期小鼠为研究对象,将其随机分为空白对照组(16m)、16m+DMSO组、16m+EGCG组,给予16m小鼠EGCG处理,50mg/kg/d,腹腔注射,连续处理8周,待小鼠18m时停止干预,以3m小鼠为对照进行如下检测:1、采用高频超声评价18m+EGCG小鼠心脏功能,与3m及18m组小鼠进行比对;2、利用Western blot及Q-PCR检测各组小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA表达水平;检测各组心肌组织中HDAC1、HDAC2及HDAC3m RNA表达水平;3、利用Ch IP技术检测cTnI启动子GATA&Mef2元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平,HDAC1、HDAC2、HDAC3与关键元件结合水平,转录因子GATA4、Mef2c与cTnI启动子关键元件结合水平。结果:1、18m+EGCG组小鼠心脏IVTR较18m组显著降低,E/A比值则显著升高(p<0.05),但与3m组无显著性差异(p>0.05);2、18m+EGCG组小鼠心脏cTnI m RNA和蛋白表达量较18m及18m+DMSO组显著增加(p<0.05),与3m组间无显著差异(p>0.05);3、18m及18m+DMSO组HDAC1及HDAC3 m RNA水平显著低于18m+EGCG及3m组(p<0.05),而HDCA2 m RNA水平在各组间无显著差异(p>0.05);4、18m+EGCG组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平高于18m及18m+DMSO组(p<0.05),与3m组间无统计学差异(p>0.05);5、18m+EGCG组及3m组HDAC1与cTnI启动子结合关键元件结合水平显著低于18m及18m+DMSO组(p<0.05),而HDAC2及HDAC3与cTnI启动子结合水平在各组间无显著差异(p>0.05);6、GATA4和Mef2c与cTnI启动子关键元件结合水平在18m+EGCG组及3m组高于18m及18m+DMSO组,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、EGCG干预可以显著改善衰老小鼠心脏舒张功能;2、EGCG干预可能通过抑制心脏中HDAC1表达,进而降低其与cTnI启动子结合水平,引起衰老期小鼠心脏cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平升高,促进对应转录因子与之结合,提升cTnI表达。