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严重急性呼吸综合征简称SARS(SevereAcuteRespiratorySyndrom)。自2002年11月,在我国广东省发现第一例病例以来,SARS迅速蔓延并相继在近30个国家出现了疫情,成为21世纪威胁全球人类健康的新型严重传染疾患。
SARS的特异诊断方法是基于微生物学及血清学研究。SARS病毒是一种新型冠状病毒,具有多种结构蛋白和非结构蛋白,感染机体后可诱导产生针对多种病毒蛋白的抗体。目前对每种抗体在疾病诊断、进程及预后的意义、抗体产生的动力学以及单一抗体与全病毒抗体的相关性仍不完全清楚。
本课题主要选用SARS冠状病毒的主要结构基因,采用PCR方法,分段扩增SARS的N基因(分为N1、N2两个片段和N全长基因)和S基因(分为S1、SC和S2三个片段),共6个基因片段。然后将各基因片段克隆到原核表达质粒载体pET30a(+)上,得到重组质粒pET-SARSN、pET-SARSN1、pET-SARSN2、pET-SARSS1、pET-SARSSC和pET-SARSS2,并使其在大肠杆菌中诱导表达。通过亲和层析、离子交换、疏水层析、电洗脱等方法对这些重组蛋白进行了纯化,得到了纯度在95%以上的目的蛋白。纯化产物经Westen-Blot鉴定均有特异性抗原活性。
检测58份SARS病人恢复期3个月的血浆,在恢复期3个月这一时间剖面上对SARS血浆中针对SARS-CoV各抗原片段的IgG抗体进行描述:SARS-CoVN、N1、N2、S1、Sc、S2和M蛋白的阳性检出率分别为:3.5%、91.4%、75.9%、50.0%、81.0%、86.2%和96.5%。可以看出恢复期3个月血浆中针对SARS-CoV各抗原片段的IgG水平各不相同。
用北京华大GBI生物技术有限公司生产的SARS冠状病毒抗体ELISA检测试剂盒检测该58份SARS恢复期血浆,其IgG检出率为89.7%,IgM检出率为1.7%。可以看出恢复期3个月血浆中IgG仍存在较高水平,而IgM则水平较低。
分析N1、N2、Sc、S2和M蛋白和全病毒检测结果的相关性,结果显示N1蛋白与N2蛋白及全病毒抗原的相关性较好(r>0.65);Sc蛋白与S2蛋白无相关关系,与全病毒抗原弱相关(r=0.396);M蛋白与N1蛋白弱相关(r=0.280),与其它蛋白及全病毒抗原均无相关关系。认为S、M蛋白作为SARS-CoV的另两个主要结构蛋白,其抗原性与N蛋白互为补充。
检测梯度稀释后的12份样品,结果显示:经梯度稀释后的血浆对SARS-CoVN、S蛋白的反应差别明显,其中P20号血浆对SARS-CoVN蛋白的反应高于S蛋白(N1和N2的稀释度为1:4和1:8;SC和S2的稀释度均为原倍),P12号血浆对SARS-CoVS蛋白的反应高于N蛋白(N1和N2的稀释度为原倍和1:2;SC和S2的稀释度为1:8和1:4)。选择该两份血浆,分别作为N蛋白和S蛋白的灵敏度检测参考。
检测40份SARS系列血清。发现针对SARS-CoVM蛋白的抗体在发病早期(10~14天)检出率(87.5%)较N,S蛋白的检出率高,提示其作为早期诊断试剂具有一定意义,随病程延长,其检出率有上升趋势;针对SARS-CoVN,S蛋白的抗体的在发病早期检出率相对较低(均低于62.5%),但随病程延长,检出率有上升趋势。
同时,对人冠状病毒OC43N蛋白和人冠状病毒229EN蛋白进行表达和纯化,并包被聚苯乙烯板,使用间接ELISA方法检测58份SARS恢复期3个月血浆,其阳性检出率均为0%,提示SARS冠状病毒与人冠状病毒无交叉反应。