【摘 要】
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维生素C是生物体中不可或缺的营养物质,在维持机体稳态方面发挥重要作用,目前已有大量临床研究表明高剂量维生素C对多种癌症的治疗有辅助效果。PTPN12是哺乳动物组织中普遍表达的蛋白质酪氨酸磷酸酶,能够通过调节多种底物的酪氨酸磷酸化影响细胞的迁移和粘附。最新的研究表明,PTPN12是癌症、糖尿病、代谢性疾病、自身免疫性疾病等疾病的潜在治疗靶标。课题组前期已经证明维生素C能以信号分子的形式,通过其受体样
【基金项目】
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中国国家自然科学基金（编号:31572405和31172279）； 陕西省重点科技创新团队计划项目（编号:2014KCT-26）；
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维生素C是生物体中不可或缺的营养物质,在维持机体稳态方面发挥重要作用,目前已有大量临床研究表明高剂量维生素C对多种癌症的治疗有辅助效果。PTPN12是哺乳动物组织中普遍表达的蛋白质酪氨酸磷酸酶,能够通过调节多种底物的酪氨酸磷酸化影响细胞的迁移和粘附。最新的研究表明,PTPN12是癌症、糖尿病、代谢性疾病、自身免疫性疾病等疾病的潜在治疗靶标。课题组前期已经证明维生素C能以信号分子的形式,通过其受体样转运蛋白SVCT2影响细胞内信号转导途径,包括JAK/STAT、MAPK/ERK等信号通路。本研究以HEK293T细胞和B16-F10细胞为靶细胞,发现维生素C通过MAPK/ERK信号通路促进PTPN12丝氨酸磷酸化,进而参与细胞内信号通路的调节。同时研究了不同浓度的维生素C通过MAPK/ERK信号通路对小鼠黑色素瘤细胞增殖、迁移的影响,并研究了PTPN12在上述过程中的作用,主要研究内容如下:1.维生素C-MAPK/ERK信号通路下游靶蛋白PTPN12的筛选及验证。首先,通过对磷酸化定量蛋白质组数据的分析和相关靶点的预测,确定了PTPN12可能作为维生素C-MAPK/ERK信号通路的靶蛋白之一;然后结合氨基酸位点突变和Western Blot等方法,确定了PTPN12上受维生素C-MAPK/ERK信号通路调控的具体磷酸化位点为第434和632位丝氨酸;使用银染、磷酸酶活性测定等方法,验证了PTPN12上Ser434、Ser632的磷酸化会抑制PTPN12磷酸酶活性。2.维生素C-MAPK/ERK-PTPN12对JAK2激酶的调节作用。首先通过免疫荧光染色和荧光共振能量转移的方法确定了细胞内PTPN12与JAK2存在共定位现象,然后结合蛋白质免疫共沉淀和Western Blot验证了PTPN12与JAK2之间存在相互作用,且PTPN12能够调节JAK2第1007/1008位酪氨酸的磷酸化,并且证明了维生素C可以通过上调PTPN12相关丝氨酸位点的磷酸化,抑制PTPN12的磷酸酶活性,进而维持细胞内JAK2激酶的激活。3.维生素C-MAPK/ERK-PTPN12途径对小鼠皮肤黑色素瘤细胞的影响。首先通过Western Blot,验证了在B16-F10细胞中,低浓度的维生素C激活ERK1/2,而高浓度维生素C持续抑制ERK1/2;接着通过细胞划线和Transwell实验,发现高浓度维生素C以依赖PTPN12的方式抑制细胞迁移,低浓度维生素C则促进细胞迁移;然后通过构建PTPN12敲降的B16-F10细胞系,验证了B16-F10细胞中PTPN12的减少会促进细胞的增殖和迁移,并引起JAK2活性的提高。4.不同浓度维生素C对小鼠原位黑色素瘤生长的影响。本研究建立了B16-F10细胞诱导的荷瘤小鼠模型,验证了PTPN12的缺失对小鼠原位黑色素瘤生长的促进作用;并通过瘤内注射不同浓度的抗坏血酸钠,验证了低浓度抗坏血酸钠促进小鼠原位黑色素瘤的生长,而高浓度抗坏血酸钠具有显著抑制的效果。综上,本研究在前期研究的基础上证明了维生素C通过激活MAPK/ERK信号通路,促进PTPN12相关位点的丝氨酸磷酸化,从而抑制PTPN12对JAK2激酶的去磷酸化、维持JAK2激酶的激活,起到正反馈调节作用;并首次发现了不同浓度的维生素C能够以PTPN12依赖的方式影响肿瘤细胞的迁移,同时探究了高浓度维生素C抑制小鼠皮肤黑色素瘤的潜在机制。
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