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目的1.研究胚胎干细胞转录因子Nanog蛋白在昆明(kunming,KM)小鼠植入前胚不同发育阶段的定位表达情况;2.研究雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)特异性抑制剂MPP(20μM)对小鼠2-细胞胚Nanog蛋白定位的影响;3.研究MPP处理对细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E定位的影响;4.研究MPP处理对Nanog和Cyclin D1、Cyclin E m RNA表达情况的影响;阐明ERa对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用,为进一步探讨ERα在小鼠植入前胚大规模合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。方法1.分别获取KM小鼠GV卵、MII卵和h CG注射后21h、27h的1-细胞胚,以及h CG注射后33h、39h、45h、51h的2-细胞胚(其中33h组含有部分1-细胞胚,51h组含部分3-细胞胚和4-细胞胚)。采用细胞免疫荧光技术,检测Nanog蛋白在小鼠植入前胚不同发育阶段的定位分布情况。2.收集KM小鼠1-细胞胚(h CG后27h),分别置于KSOM培养液(对照组)及添加有20μM MPP的培养液(实验组)中进行体外培养,获取发育至2-细胞阶段(h CG后45h)的植入前胚,利用细胞免疫荧光技术,检测两组细胞Nanog蛋白的定位表达情况。3.收集KM小鼠1-细胞胚(h CG后27h),分别置于KSOM培养液及添加有20μM MPP的培养液中进行体外培养,获取发育至2-细胞阶段(h CG后45h、48h)的植入前胚,利用细胞免疫荧光技术,检测两组细胞Cyclin D1和Cyclin E蛋白的定位表达情况。4.收集KM小鼠1-细胞胚(h CG后27h),分别置于KSOM培养液及添加有20μM MPP的培养液中进行体外培养,获取发育至2-细胞阶段(h CG后45h)的植入前胚,利用Real Time-PCR技术,检测两组细胞Nanog与Cyclin D1、Cyclin E的m RNA表达水平。结果1.细胞免疫荧光染色结果显示,在小鼠GV卵、MII卵和h CG注射后21h、27h以及33h的1-细胞胚中均未观察到Nanog表达;而h CG注射后33h、39h、45h和51h的2-细胞胚中可见Nanog表达;而且Nanog在2-细胞胚中的表达水平于h CG后39h最高,在h CG后45h、51h,表达水平下降;另外,于h CG后51h收集的3-细胞胚和4-细胞胚中的Nanog蛋白表达水平极低。2.经27-45h MPP(20μM)处理后,小鼠2-细胞胚内Nanog总体荧光强度较KSOM组明显减弱(P<0.01),且细胞核内的Nanog荧光强度与KSOM组比较,也明显下降(P<0.01)。3.经27-45h MPP(20μM)处理后,2-细胞胚内Cyclin D1总体荧光强度较KSOM组明显下降(P<0.01);细胞核内Cyclin D1荧光强度较KSOM组明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。经27-48h MPP(20μM)处理后,2-细胞胚内Cyclin E总体荧光强度较KSOM组明显减弱(P<0.01);2-细胞胚核内的Cyclin E荧光强度也明显下降(P<0.01)。4.Real Time-PCR结果显示:与KSOM对照组比较,MPP(20μM)组2-细胞胚内Nanog、Cyclin D1 m RNA表达水平无明显改变,差异不具有统计学意义(P>0.05);而Cyclin E m RNA表达水平明显下调(P<0.01)。结论Nanog蛋白在小鼠植入前胚早期阶段性高表达于h CG后39h,提示Nanog可能参与小鼠2-细胞胚G1/S期过渡,以及参与调控大规模合子基因组激活。经MPP(20μM)处理后,Nanog蛋白以及G1/S期过渡相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E在2-细胞胚中表达量较KSOM组明显下调;另外较KSOM组Nanog、Cyclin D1的m RNA表达水平不受影响,而Cyclin E m RNA水平较KSOM组明显下调,提示ERα可能调控Nanog、Cyclin D1转录后蛋白翻译水平,而对Cyclin E在转录与蛋白翻译水平均有影响。