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随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大,病害同益严重并造成巨大的经济损失,成为生产发展的主要制约因素,及时有效地防治疾病危害已成为满足中华绒螯蟹养殖业持续发展的迫切要求。研究中华绒螯蟹的免疫功能,提高其自身免疫力,是解决其病害防治问题的重要途径之一。本论文对中华绒螫蟹血淋巴的抗菌活性,血淋巴酚氧化酶的部分生化特性,血清的凝集活性,血细胞的体外吞噬能力以及对细菌的清除作用等基础免疫功能进行了初步研究,探讨了中华绒螫蟹对细菌的清除作用,部分免疫因子的性质及其在细菌清除中的作用,以期能够为中华绒螯蟹细菌性疾病免疫防治工作的开展提供理论参考。
产生抗菌物质对于甲壳动物清除侵入体内细菌,维持机体健康具有重要作用,因此探讨了中华绒螯蟹血清和血细胞溶解上清液(HLS)对大肠杆菌Escherichiacoli、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus4种细菌的抗菌活性、不同浓度血细胞溶解上清液(Hemocyte Lysate Supernatant,HLS)对抗菌活性的影响以及血清中抗菌活性的诱导。结果显示,只有HLS对大肠杆菌、嗜水气单胞菌表现出显著的抗菌活性,而血清对4种菌和HLS对蜡状芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌均未表现出抗菌活性;随着HLS浓度的降低,大肠杆菌的细菌存活指数(SI)迅速上升,抗菌活性迅速下降,HLS浓度高低直接影响抗菌活性的强弱;通过注射灭活大肠杆菌,血清在1h-24h内表现出抗菌活性的诱导作用,6h时抗菌活性最强。
酚氧化酶原系统对甲壳动物的免疫识别及免疫调理功能具有重要作用,故对中华绒螯蟹血淋巴的血清、血浆和血细胞溶解上清液(HLS)中酚氧化酶(PO)的活力以及该酶最适pH和温度进行了初步研究,结果表明在血清和HLS中都有PO活力,而血浆中无PO的存在,血清中的PO来自于血细胞;以L-Dopa为底物,中华绒螫蟹.PO活力的最适pH值为6.5,最适温度为40℃。采用SDS、Ca<2+>、Mg<2+>以及SDS与Ca<2+>联合和SDS与Mg<2+>联合分别对酚氧化酶原(proPO)进行激活实验,血清和HLS中的PO活力都有显著的增加,其中SDS的激活作用最强,Ca<2+>、Mg<2+>的激活作用最弱,SDS与Ca<2+>联合和SDS与.Mg<2+>联合的混合激活作用介于SDS和Ca<2+>、Mg<2+>之间,激活实验表明中华绒螫蟹的PO主要以酚氧化酶原(proPO)形式存在于血细胞中。
甲壳动物凝集素具有多种生理生化功能,如能够凝集细菌、细胞;增强细胞吞噬活性等。以醛化红细胞为实验材料,确定了中华绒螯蟹血清中含有能够凝集醛化鸡红细胞和醛化鼠红细胞的凝集素,其凝集效价分别为2<4>和2<7>,但中华绒螫蟹血清对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌无凝集活性。利用血清能够凝集醛化鸡红细胞的特点,对凝集素进行了初步分离,经SDS-PAGE电泳测得其分子量为77kDa。
吞噬作用是甲壳动物保护自身免受微生物侵害的重要免疫功能,测定其体外吞噬能力对于评价免疫系统的状态具有重要意义。采用体外血细胞培养的方法,研究了中华绒螯蟹血细胞对蜡状芽孢杆菌和醛化鼠红细胞的吞噬能力。结果表明:在体外,贴壁培养的中华绒螯蟹血细胞1hr的存活率可达92.5±0.9%。少量的细胞呈圆形或椭圆形,细胞内含有大量具有明显的折光性的颗粒,细胞贴壁性能差;绝大部分贴壁的细胞,呈扁平状,其胞质内含有一个明显的细胞核和一些小的颗粒,紧密地贴附于玻片上并伸出类似于伪足的原生质突起,伸展后血细胞的长度可达数十微米,具有吞噬功能,其对蜡状芽胞杆菌吞噬率为5.1±1.4%,不能吞噬小鼠红细胞,血清孵育不能增强中华绒鳌蟹血细胞体外吞噬能力。
在对中华绒螯蟹几种免疫因子体外研究的基础上,探讨了中华绒螯蟹对侵入体内细菌的清除作用。首先采用颜料法确定了中华绒螯蟹循环血体积(V)与体重(T)问的回归曲线方程V=0.1576T-0.898(Rs=0.83,P<0.01),循环血体积与体重的百分比(V/T)为14.86±2.95%。在确定中华绒螯蟹循环血体积的基础上,通过注射革兰氏阳性蜡状芽孢杆菌和革兰氏阴性大肠杆菌,探讨进入中华绒螯蟹体内细菌随时间变化的清除规律以及通过组织学观察探讨细菌的清除方式。结果表明:中华绒螯蟹对两种细菌的清除作用相似,在注射菌后60min时对蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌的细菌清除率都达到最高,分别为88.57±4.84%和90.15±3.88%,120min时对两种细菌清除率与60min时相比无显著性差异(P>0.05);中华绒螯蟹的鳃和心脏中血细胞都可聚集而形成血细胞团、并具有对细菌的包裹和吞噬作用,血细胞团的形成以及包裹和吞噬的作用是中华绒螯蟹清除细菌的重要途径。