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第一部分中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因突变分析
目的：原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是儿童时期最常见的肾小球疾病,根据患儿对糖皮质激素治疗的疗效,PNS被分成激素敏感型肾病综合征(steroid-sensitive nephrotic syndrome,SSNS)和激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)。为探讨中国南方汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因突变及其特点,我们对3个中国南方汉族人家族性SRNS家系进行了NPHS2基因突变分析。
方法：研究对象为A、B、C 3个南方汉族人SRNS家系先证者及其姐姐和父母,50例尿检正常的南方汉族健康成年人作为对照人群。取所有研究对象外周静脉血3ml,10％枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增NPHS2基因全部8个外显子及其周围的部分内含子和启动子全长序列(大约2.6kb),对PCR产物直接进行DNA序列测定。
结果：对3个南方汉族人SRNS家系先证者NPHS2基因全部8个外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现NPHS2基因致病突变,仅在外显子8上检测到1个NPHS2基因多态性(954T>C)。在3个家系的先证者及其姐姐和父母的NPHS2基因启动子上检测到6个变异:-1715A>G、-1709G>A、-1000A>T、-670C>T、-116C>T和-51G>T。
结论：本研究对3个中国南方汉族人常染色体隐性遗传的SRNS家系先证者的NPHS2基因的全部8个外显子及其周围的部分内含子和启动子全长进行了突变分析,未发现NPHS2基因致病突变,但在外显子8发现了一个已报道的基因多态性,在启动子新发现了1个变异和1个基因多态性以及4个已报道的基因多态性,提示NPHS2基因突变不是本研究3个SRNS家系的主要致病因为。
第二部分 中国汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系WT1基因突变分析
目的：PNS是儿童时期最常见的肾小球疾病,其主要临床特征为大量蛋白尿。大约10％～20％PNS患儿对激素治疗耐药,即SRNS,其中大部分患儿逐渐进展到ESRD。NPHS2是常染色体隐性遗传型家族性SRNS的常见致病基因之一,但由于遗传背景的差异,部分家族性SRNS非NPHS2基因突变所致。WT1是一种锌指样转录因子,研究表明它是足细胞的两个特异基因(NPHS1和NPHS2)的上游调节基因,在SRNS的发生过程中起着重要的调节作用。WT1基因突变可引起Denys-Drash综合征等多种肾小球疾病。我们对3个中国汉族人家族性SRNS家系进行了WT1基因突变分析。
方法：研究对象为A、B、C 3个中国南方汉族人SRNS家系的先证者及其姐和父母,50例尿检正常的中国南方汉族健康成年人作为对照人群。取所有研究对象外周静脉血3ml,10％枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。PCR方法扩增WT1基因全部10个外显子及其周围的部分内含子,PCR方法扩增WT1基因全部10个外显子及其周围的部分内含子,应用对PCR产物直接进行DNA序列测定法和PCR/限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测WT1基因变异。
结果：对3个中国汉族人SRNS家系的先证者WT1基因全部10个外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现WT1基因致病突变,但在3个SRNS家系的先证者WT1基因外显子检测到2个变异-126C>T(P42P)和903A>G(R300R)。这2个变异在100条正常染色体中也有检出,提示它们均为WT1基因多态性。在家系C的先证者WT1基因内含子区检测到1个变异-IVS5-64A>G。这个变异在100条正常染色体中也有检出,提示它亦为WT1基因多态性。126C>T、903A>G和IVS5-64A>G多态性在对照人群中的等位基因频率分别为0.67、0.71和0.02。126C>T和903A>G多态性已见文献报道,IVS5-64A>G为新发现的WT1基因多态性。
结论：本研究对3个中国汉族人常染色体隐性遗传型SRNS家系先证者的WT1基因的全部10个外显子及其周围的部分内含子进行了突变分析,未发现WT1基因致病突变,但发现了2个已经报道的WT1基因多态性和1个新发现的WT1基因多态性,提示WT1基因突变不是本研究3个SRNS家系的主要致病因为。
第三部分 中国汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系PLCE1基因突变分析
目的：PNS是儿童时期最常见的肾小球疾病,约10％～20％PNS患儿对激素治疗耐药(SRNS),其中大部分患儿逐渐进展到ESRD,需要肾替代治疗如透析或肾移植生存。迄今,已经证实有8个不同的单基因突变能够导致人类SRNS,它们分别为NPHS1、LAMβ2、CD2AP、ACTN4、TRPC6、NPHS2、WT1和PLCE1基因；其中NPHS1、LAMβ2、CD2AP、NPHS2、WT1和PLCE1基因突变可以引起常染色体隐性遗传型SRNS。鉴于国际上有发现PLCE1基因突变可引起家族性SRNS,发病年龄为0.2岁～8.8岁,而国内尚未见对SRNS儿童进行PLCE1基因突变分析的报道,为进一步分析我国汉族人家族性SRNS家系的致病基因及其特点,我们在对3个常染色体隐性遗传的SRNS家系进行NPHS2和WT1基因突变分析之后,又对他们进行了PLCE1基因突变分析。
方法：研究对象为A、B、C 3个南方汉族人SRNS家系先证者及其姐姐和父母,50例尿检正常的南方汉族健康成年人作为对照人群。取所有研究对象外周静脉血3ml,10％枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。PCR方法扩增PLCE1基因全部31个编码外显子及其周围的部分内含子区。应用对PCR产物直接进行DNA序列测定法和PCR-RFLP方法检测PLCE1基因变异。
结果：对3个中国汉族人SRNS家系先证者在3个家系的先证者PLCE1基因的全部31个编码外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现PLCE1基因致病突变,但检测到13个变异。
结论：本研究对3个中国汉族人常染色体隐性遗传型SRNS家系先证者PLCE1基因的全部编码外显子及其周围的部分内含子进行了突变分析,未发现PLCE1基因致病突变,但发现了12个已报道的和1个新发现的PLCE1基因多态性,提示PLCE1基因突变也不是本研究3个汉族人SRNS家系的主要致病因子。
第四部分 中国南方汉族人散发性激素耐药型肾病综合征儿童NPHS2基因突变分析
目的：PNS是儿童时期最常见的肾小球疾病,临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。80％～90％PNS患儿对激素治疗敏感,预后良好；然而,10％～20％PNS患儿对激素治疗耐药,即SRNS。为分析我国南方汉族人散发性SRNS儿童NPHS2基因突变及其特点,我们对收集到的15例中国南方汉族人散发性SRNS儿童进行了NPHS2基因突变分析。
方法：研究对象为15例南方汉族人散发性SRNS儿童,50例尿检正常的南方汉族健康成年人作为对照人群。取所有研究对象外周静脉血3ml,10％枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。
结果：对15例南方汉族人散发性SRNS儿童NPHS2基因全部8个外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现NPHS2基因致病突变,但在其中13例SRNS儿童的NPHS2基因外显子上检测到两个变异。
结论：本研究对15例中国南方汉族人散发性SRNS患儿NPHS2基因的全部外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现NPHS2基因致病突变,但检测到2个已报道的NPHS2基因多态性,提示NPHS2基因突变不是本研究15例中国南方汉族人散发性SRNS儿童的主要致病因为。
第五部分 激素依赖型肾病综合征儿童NPHS2基因突变分析
目的：为了进一步探讨中国SDNS儿童NPHS2基因突变及其特点,我们对1例中国SDNS儿童进行了NPHS2基因突变分析。
方法:研究对象为1例SDNS患儿及其父母、弟弟,50例尿检正常成年人。分别取所有研究对象的外周静脉血各3ml,10％枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。应用PCR方法扩增患儿NPHS2基因的全部8个外显子及其启动子全长,对PCR产物直接进行DNA序列测定。
结果：在SDNS患儿NPHS2基因外显子5上检测到1个杂合错义突变-596A>T；在NPHS2基因外显子8上检测到1个杂合同义突变-954T>C(A318A)。此外,在该患儿NPHS2基因启动子区检测到-116C>T纯合变异。其母亲和弟弟NPHS2基因上也检测到596A>T的杂合错义突变和954T>C杂合同义突变。其母亲NPHS2基因启动子区也检测到-116C>T纯合变异。在其父亲和弟弟NPHS2基因启动子区检测到-116C>T杂合变异。但患儿的父母和弟弟尿检均正常。
结论：本研究在1例SDNS中国儿童NPHS2基因编码区发现了1个N199I杂合错义突变和1个A318A杂合同义突变,在启动子区发现了-116C>T纯合变异、提示该肾病综合征患儿对激素依赖可能与NPHS2基因变异有关。