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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的自身免疫性疾病。研究表明B细胞在RA的发病机制中发挥着重要作用。B细胞的异常活化会产生大量自身抗体,诱发或加重RA的病情与骨质破坏。免疫球蛋白Fc段受体IIb（FcγRIIB）是负向调节B细胞受体（B cells receptor,BCR）信号的重要穿膜受体,其主要功能是抑制B细胞的活化,诱导外周免疫耐受。但FcγRIIb-I232T基因变异会减弱其抑制B细胞活化的功能,更为重要的是,研究发现FcγRIIB是可以被调控的,在活动期RA患者中出现功能失调,而在病情得到控制的非活动期RA患者中则功能恢复正常,使其成为非常具有潜力的RA治疗新靶点。课题组前期研究发现,与非肾虚RA患者比较,肾虚RA患者中存在高频率的FcγRIIb-I232T基因变异,提示肾虚与FcγRIIb基因变异具有一定的相关性。基于以上研究,导师陈光星教授以从肾论治为法,创立益肾通痹汤治疗RA。课题组前期临床研究发现,益肾通痹汤能够明显缓解活动期RA患者关节肿痛、晨僵等临床症状,改善关节功能,降低活动期炎症因子水平。但其治疗RA的分子机制仍不清楚。目的:通过观察益肾通痹汤对胶原诱导性关节炎大鼠模型（collagen induced arthritis,CIA）炎症与骨破坏的抑制作用,以及益肾通痹汤氯仿部位提取物（YSTB-C）对B细胞CD19/FcγRIIb-Lyn-SHP-1信号通路的调控作用,阐释益肾通痹汤治疗RA的具体分子机制,为RA的中医特色治疗提供科学数据。方法:1.动物实验:益肾通痹汤对CIA大鼠模型炎症与骨破坏的抑制作用（1）选用SPF级雌性Wistar大鼠,随机分为空白组（Con）、模型组（Mod）、益肾通痹汤低剂量组（YSTB-L）、益肾通痹汤中剂量组（YSTB-M）、益肾通痹汤高剂量组（YSTB-H）、甲氨蝶呤组（MTX）,每组各10只。益肾通痹汤各浓度组分别灌胃益肾通痹汤溶液(4.5、9、18g·kg-1·d-1),MTX组灌胃甲氨蝶呤溶液(1.35mg·kg-1·w-1),其余两组灌胃等体积0.9%Na Cl溶液。实验过程中每隔3天评估一次大鼠体质量、足肿值及关节炎指数（arthritis index,AI）评分。（2）益肾通痹汤灌胃34天后,对大鼠四肢关节进行X光拍摄,由影像科医生对大鼠四肢关节X光片进行盲法评价:骨侵蚀评分和关节间隙狭窄（joint space narrowing,JSN）评分。（3）益肾通痹汤灌胃34天后,取大鼠左前肢和右后肢第3足趾关节进行HE染色,采用盲法评估足趾关节HE病理片:炎症评分、滑膜细胞增殖评分、关节软骨破坏评分。2.细胞实验:益肾通痹汤对ST486细胞增殖、凋亡及活化的影响,以及对ST486细胞CD19/FcγRIIb-Lyn-SHP-1信号通路的调控作用（1）构建FcγRIIb-I232T基因缺陷细胞系FcγRIIb-vector（空载）、FcγRIIb-WT（野生型）、FcγRIIb-I232T（突变型）质粒分别转染缺乏内源性FcγRIIb基因的人伯基特B淋巴瘤细胞,构建基因缺陷细胞模型ST486。通过RT-q PCR和Western Blot法分别从m RNA和蛋白两个层面验证转染效率,基因缺陷细胞模型ST486构建成功后用于后续细胞实验。（2）不同浓度YSTB-C对ST486细胞增殖、凋亡及活化的影响分别以0ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml浓度YSTB-C干预ST486细胞48h,CCK-8法检测各组细胞增殖水平;以250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml浓度YSTB-C干预ST486细胞48h,流式细胞术检测各组细胞的总凋亡率;以250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml浓度YSTB-C干预ST486细胞,流式细胞术观察800s内ST486细胞内Ca2+通量的动态变化。（3）不同浓度YSTB-C对ST486细胞CD19/FcγRIIb-Lyn-SHP-1的调控作用。分别以250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml浓度YSTB-C干预ST486细胞48h,Western Blot法检测各组细胞CD19、FcγRIIb、Lyn、SHP-1蛋白的表达变化。结果:1.动物实验（1）大鼠一般情况变化模型组大鼠出现被毛无光泽、蜷缩背弓现象,活动量减少,时有大便溏薄;益肾通痹汤组及甲氨蝶呤组大鼠精神状态、行为活动较模型组改善。（2）大鼠体质量的变化自CIA模型建立后,与空白组比较,其余5组大鼠体质量均显著降低（P<0.01）;与模型组比较,益肾通痹汤不同浓度组及MTX组大鼠体质量在25-34天均较高,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01）。（3）大鼠足肿值的比较CIA大鼠足肿值在成模后第7天达到高峰。与空白组比较,模型组大鼠足肿值显著升高（P<0.01）;与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组从第4天开始足肿值显著降低（P<0.01）,MTX组从第10天开始大鼠足肿值显著降低（P<0.01）。（4）大鼠关节炎指数评分比较与模型组比较,益肾通痹汤各浓度组大鼠AI评分持续降低,以YSTB-M与YSTB-H组为著。与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组在第10天开始AI评分显著降低（P<0.01,P<0.01）,MTX组在第16天开始AI评分显著降低（P<0.05）。（5）大鼠骨侵蚀评分比较与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组骨侵蚀评分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.01）;与MTX组比较,YSTB-M与YSTB-H组骨侵蚀评分虽有降低,但差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。（6）大鼠JSN评分比较与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组JSN评分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.01）;与MTX组比较,YSTB-M与YSTB-H组JSN评分均较高,但差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。（7）大鼠炎症评分比较与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组炎症评分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01,P<0.01）;与MTX组比较,YSTB-M与YSTB-H组炎症评分均较高,但差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。（8）大鼠滑膜细胞增殖评分比较与模型组比较,YSTB-H组滑膜细胞增殖评分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与MTX组比较,YSTB-M与YSTB-H组滑膜细胞增殖评分均较高,但差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。（9）大鼠关节软骨破坏评分比较与模型组比较,YSTB-M与YSTB-H组关节软骨破坏评分均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与MTX组比较,YSTB-M与YSTB-H组关节软骨破坏评分均较高,但差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。2.细胞实验（1）与空白组比较,WT组FcγRIIb m RNA与蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01,P<0.01）,Mut组FcγRIIb m RNA与蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01,P<0.01）;与WT组比较,Mut组FcγRIIb m RNA与蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01,P<0.01）,提示FcγRIIb基因缺陷细胞模型ST486构建成功。（2）不同浓度YSTB-C对ST486细胞增殖具有显著的抑制作用,并呈现浓度依赖性（P<0.01,P<0.01,P<0.01）,500ng/ml浓度的YSTB-C作用ST486细胞48h可达到50%细胞抑制率。（3）与Mut组比较,低浓度的YSTB-C对ST486细胞凋亡无显著影响（P>0.05）;中、高浓度的YSTB-C对ST486细胞凋亡具有显著的促进作用（P<0.01,P<0.01）。（4）流式细胞术动态观察结果显示,与Mut组比较,不同浓度的YSTB-C对ST486细胞内Ca2+通量具有显著的抑制作用（P<0.05,P<0.01,P<0.01）,提示YSTB-C可抑制ST486细胞的活化。（5）Western Blot实验发现,与Mut组比较,高浓度的YSTB-C可降低ST486细胞内CD19的磷酸化水平（P<0.05）,提示YSTB-C高剂量组可能通过降低CD19的磷酸化水平来抑制ST486细胞的活化。（6）Western Blot实验发现,与Mut组比较,中高浓度的YSTB-C可上调ST486细胞内FcγRIIb蛋白水平（P<0.05,P<0.05）;高浓度的YSTB-C可上调ST486细胞内Lyn蛋白水平（P<0.05）;高浓度的YSTB-C可上调ST486细胞内SHP-1蛋白水平（P<0.05）,提示YSTB-C高浓度组可通过激活FcγRIIb/Lyn/SHP-1通路来抑制ST486细胞的活化。结论:1.益肾通痹汤可减轻CIA大鼠的炎症反应并抑制骨破坏。2.益肾通痹汤氯仿部位提取物可抑制ST486细胞（FcγRIIb基因突变细胞模型）的增殖、活化,诱导其凋亡,其机制可能与CD19/FcγRIIb-Lyn-SHP-1信号通路调节相关。