干细胞具有多向分化潜能和丰富的细胞功能,对干细胞的基因修饰和基于干细胞的神经组织修复策略长期以来受到广泛关注。其中,对于中枢神经系统疾病,如脊髓损伤(SCI),其发生后呈现复杂的动态病程和病理状况,加之中枢神经组织自愈力低,对损伤后神经功能的恢复不但需要进行神经细胞的补充,还必须克服细胞外基质缺失以及组织微环境炎症反应等多方面的不利因素。如何建立能够在SCI发生后实现有效的神经功能恢复的多功能复合疗法,已经成为科学研究及临床治疗中的热点和亟待解决的难点问题。本文研究针对严重SCI后的神经组织修复这一难题,结合基因传递、干细胞疗法及局部缓控释递药手段,构建新型的多功能复合埋植体系。研究建立脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC),结合临床治疗脊髓损伤的抗炎药物甲基泼尼松龙(甲泼尼龙,MP),进行脊髓组织的联合埋植治疗。首先,实验通过对MSC基因转染体系的优化和系统研究,制备BDNF基因修饰的MSC,另一方面,构建甲泼尼龙明胶微球(MPGM)缓释制剂以克服MP全身用药的系统毒副作用和脊髓组织利用率低的问题。同时,为实现干细胞与药物制剂的脊髓局部埋植,本研究基于天然细胞外基质成分透明质酸(HA)的交联反应和黏附肽的修饰建立三维凝胶埋植支架载体,利用该载体包载基因修饰的MSC和MPGM进行SCI后的神经组织修复,通过体内外考察,对这一复合埋植体系的治疗效果进行评价,并对复合埋植体系内各组分在神经恢复中的功能及各组分的联合作用方式进行了探讨。为建立高效低毒的MSC基因转染体系,本文对新型脂质载体Screenfect A(SF)在MSC中的基因转染进行了优化和系统研究。基于SF所优化的MSC基因转染体系可以实现较高的基因转染效率,并同时保持MSC良好的细胞活性。进一步考察发现,SF在质粒的细胞摄取和表达阳性率中的表现与LipofectamineTM 2000(Lipo)相当,但SF的转染显示了更高的细胞平均表达水平和MSC增殖活性,且血清对SF转染MSC的效率及细胞活性的影响皆较小。相比常用脂质载体Lipo,基于SF的基因传递明显减少质粒用量,在对基因转染效率及MSC细胞活性的兼顾中显示明显的优势。进一步对SF所携载质粒的胞内转运行为的考察发现,质粒可于转染0.5h之内开始入胞,顺利进行溶酶体逃逸,进而于4h之内逐渐进入MSC细胞核。为了补充受损组织中缺失的细胞外基质,避免所埋植MSC的流失和细胞死亡,并为受损组织提供支撑和桥接,本研究基于HA构建三维凝胶支架埋植载体。研究通过对HA分子量和支架制备处方的优化筛选,获得具有三维多孔网状结构和一定力学强度的凝胶支架。为了提高支架的细胞相容性,促进MSC在支架内的黏附生长,研究引入源于层粘连蛋白链的多肽PPFLMLLKGSTR对凝胶支架进行表面修饰。体外实验结果显示,黏附肽的修饰显著提高了 HA凝胶支架对MSC的细胞相容性,MSC可于肽修饰的支架中黏附生长并长期存活。实验进一步对埋植体系的体内脊髓组织相容性及在体内对MSC的支持作用进行考察,将携载MSC的支架埋植入脊髓组织,肽修饰的支架本身即显示了良好的组织桥接功能,同时可显著提高MSC在组织中的存活。通过对支架-细胞复合埋植及二者单独埋植的研究分析发现,支架载体与干细胞在脊髓修复过程中具有明显的协同作用:支架载体或MSC单独埋植时作用微弱,而二者复合埋植后显著提高了脊髓组织完整性,对大鼠运动功能恢复和组织神经丝重建发挥了显著的促进作用。进一步对组织内继发性损伤初期情况的考察初步揭示了复合埋植体系发挥显著修复作用的可能原因,即干细胞与支架载体的埋植对炎症细胞浸润和胶质疤痕形成具有协同抑制作用。基于对支架载体体内外相容性和与MSC之间协同作用的探讨,本研究进一步利用所构建的支架载体携载BDNF基因修饰的MSC进行SCI后的神经组织修复治疗。体外实验结果显示,支架载体可支持基因修饰的MSC的长期存活及对所修饰基因的表达。体内埋植后,对MSC的BDNF基因修饰及支架的携载,都显著增强了 MSC细胞促进脊髓修复的作用,埋植治疗可明显抑制胶质疤痕形成,同时重建组织中的神经丝,在桥接脊髓神经组织的基础上,明显改善脊髓组织内的细胞形态。对于与支架共同埋植的MSC,BDNF的基因修饰可促进MSC存活以及对神经组织的修复作用,但对于缺少支架携载的MSC,其BDNF基因修饰对细胞功能的增强效果则极其有限,进一步证明支架载体对MSC脊髓埋植的重要作用。为将抗炎药物MP进行局部埋植以克服其全身用药的毒副作用和利用率低的问题,本研究制备甲泼尼龙明胶微球缓释制剂。分别对甲泼尼龙琥珀酸钠明胶微球(MPSS-GM)、琥珀酸甲泼尼龙明胶微球(MPH-GM)和甲泼尼龙明胶微球(MPGM)三种微球进行药物释放性质的研究,考察支架的肽修饰体系对微球最终包载药量和释药性质的影响,结果发现,经过支架肽修饰体系的处理后,MPSS-GM只保留极少量药物,MPH-GM保留部分药物且释放较快速,而MPGM保留了最多的药物且释药时间最长。实验建立MP的高效液相分析方法学,对MPGM释药性质的进一步研究显示其可实现400小时以上的持续释药。为了实现MPGM在脊髓组织中的埋植,实验进一步利用肽修饰支架包载MPGM。体外考察发现,包载MPGM的肽修饰支架仍具有药物缓释功能和良好的MSC细胞相容性。利用肽修饰的支架携载MPGM和基因修饰MSC进行联合埋植,体内试验结果显示,MP和BDNF-MSC在脊髓组织中的联合埋植可有效调节组织中炎症反应,埋植7天时对促炎因子的下调作用和抑炎因子的上调作用最为明显,14天和28天时,联合埋植仍显示明显的抑炎作用,并显著促进了脊髓组织再生。对包载空白GM的支架携载BDNF-MSC进行埋植的研究,显示其也具有一定的炎症缓解作用,与前期对支架和MSC埋植的结果一致,也揭示了复合埋植体系中微球和MP的作用。本课题为了实现基因修饰的干细胞和甲泼尼龙药物在脊髓组织局部的联合递送,对MSC的非病毒基因转染体系和甲泼尼龙的缓释制剂进行研究,并构建一种对干细胞和神经组织相容性良好的肽修饰的HA埋植支架载体。研究通过对携载埋植后的脊髓修复情况的研究,逐步揭示了干细胞、BNDF基因修饰、甲泼尼龙缓释给药和埋植支架载体在神经组织修复中的功能,本研究为共载干细胞与药物的埋植体系的构建提供了理论与实验依据。