动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的心血管疾病,排在发病率和死亡率首位。高脂血症是引起AS的重要而独立的危险因子之一。有研究报道,由高脂血症诱发的大动脉的炎症反应和氧化应激状态可出现在高脂饲料喂养后的几天之内,远较脂质条纹出现要早。炎症因子及氧化应激产物均可通过多种途径刺激血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖,在AS晚期纤维化斑块的形成过程中起着重要作用。因此抗炎、抗氧化应激治疗已成为预防和治疗AS的重要手段。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)介导了包括肌动蛋白骨架形成、细胞收缩、细胞粘附与迁移、基因表达、增殖凋亡等多种细胞功能。ROCK的高表达或过度激活与许多心血管疾病,如高血压、再狭窄、AS、肺动脉高压、脑血管痉挛、缺血再灌注损伤的发生有关。他汀类药物的“多效性”作用,即调脂以外的抗炎、改善内皮功能等作用,被证明至少部分是通过抑制Rho激酶途径介导的。因此,Rho激酶已成为临床上多种心血管疾病的治疗靶点。法舒地尔(fasudil,Fas)是第一个也是惟一应用于临床的Rho激酶抑制剂,主要用于治疗蛛网膜下腔出血所致的脑血管痉挛及相关的神经系统缺血症状。在许多已开展的临床前期研究中,发现法舒地尔对包括冠状动脉痉挛、高血压、肺动脉高压、冠脉再通手术后的再狭窄和AS在内的多种心血管疾病均有良好的治疗作用,长期使用未见明显副作用。同时作为一种选择性Rho激酶抑制剂,法舒地尔也常常被作为体内、外研究的工具来探讨Rho激酶的生理和病理作用。近年来有关Rho激酶信号通路与AS关系的报道逐年增加,但Rho激酶通路在高脂血症阶段与炎症和氧化应激的关系,以及对氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,ox-LDL)诱导的VSMC增殖影响的研究尚未见报道。本实验采用选择性Rho激酶抑制剂法舒地尔作为工具,研究了:(1)Rho激酶信号通路对高脂血症大鼠炎症反应的影响;(2)Rho激酶信号通路对高脂血症大鼠氧化应激的影响;(3)Rho激酶信号通路对ox-LDL诱导的VSMC增殖的影响。第一部分Rho激酶信号通路对高脂血症大鼠炎症反应的影响及法舒地尔的抗炎作用研究目的:探讨Rho激酶信号通路在高脂血症大鼠炎症反应中的作用及法舒地尔的抗炎作用。方法:清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,体重170～210 g,随机分成5组:正常对照组、模型对照组、法舒地尔低剂量组、法舒地尔高剂量组及辛伐他汀组,每组6只。除正常对照组外,其余各组大鼠喂饲高胆固醇饲料(high cholesterol diet,HCD),连续30 d。给予HCD14 d后,法舒地尔低、高剂量组分别给予法舒地尔10、30 mg/kg/d,分两次腹腔注射给药,辛伐他汀组灌胃给予辛伐他汀10 mg/kg/d,模型对照组腹腔注射生理盐水0.1 ml/kg/d,治疗共持续14 d。停药、停食24 h后,断头取血,分离血清,留取主动脉,分别测定下列指标:(1)空腹血脂:分别测定总胆固醇(total cholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol,LDL);(2)血清炎症因子:分别测定白细胞介素(interleukin,IL)-6,白细胞介素-8(IL-6),C-反应蛋白(C-reaction protein,CRP)和可溶性细胞间粘附分子(soluble intercellular adhesion molecule,sICAM);(3)反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测主动脉核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)p65亚单位及ROCK mRNA的表达;(4)Western blot测定主动脉磷酸化的肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚基(phosphorylated myosin phosphatase target subunit,p-MYPT)-1的表达,以示ROCK活性变化;(5)免疫组化法检测主动脉壁内NF-κB p65亚单位的表达和定位;(6)主动脉组织病理学检测:观察主动脉炎症变化。结果:1空腹血脂:与正常对照组相比,模型对照组血清TC和LDL-C水平明显增高(均P<0.05),而TG和HDL-C水平明显降低(均P<0.05)。与模型对照组相比,给予辛伐他汀明显降低了TC和LDL-C水平(均P<0.05),并升高了HDL-C水平(P<0.05),对TG没有影响。两个剂量的法舒地尔均明显降低了TC的水平(均P<0.05),高剂量组更加明显;高剂量的法舒地尔明显升高了HDL-C的水平;两个剂量的法舒地尔均有降低TG的趋势,但没有统计学差异;法舒地尔对LDL-C没有产生影响。2血清炎症因子水平:与正常对照组相比,模型对照组的血清CRP,sICAM,IL-6和IL-8均有明显升高(均P<0.05);辛伐他汀治疗明显降低了CRP,sICAM,IL-6,和IL-8的水平(均P<0.05),两个剂量的法舒地尔均明显降低了sICAM,IL-6和IL-8的水平(均P<0.05),但只有高剂量的法舒地尔明显降低了CRP水平(P<0.05)。3主动脉ROCK mRNA表达和蛋白活性的变化:RT-PCR结果显示模型对照组主动脉内ROCK mRNA表达较正常对照明显增高(P<0.05),经辛伐他汀和法舒地尔干预后,Rho激酶mRNA表达较模型对照组明显下降(均P<0.05)。Western blot结果显示模型对照组主动脉内p-MYPT1蛋白水平较正常对照组明显上调(P<0.05);与模型对照组相比,辛伐他汀和法舒地尔明显抑制了p-MYPT1蛋白的表达(均P<0.05)。4主动脉NF-κB mRNA和蛋白的表达及定位:RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型对照组NF-κB p65亚单位mRNA的表达明显上调(P<0.05)。而经辛伐他汀和法舒地尔干预后,NF-κB p65亚单位mRNA表达显著下降(均P<0.05)。免疫组化结果显示,NF-κB p65亚单位在正常对照组主动脉壁内仅有极少量表达,内皮细胞核内未见表达;而模型对照组明显增高,不仅见于内皮细胞,也可见于平滑肌细胞,且主要分布于细胞核内;经辛伐他汀和法舒地尔干预后,其表达水平明显下降。5主动脉组织病理学检查:模型对照组大鼠主动脉壁的内膜和中膜较正常对照组有增厚,经辛伐他汀和法舒地尔干预后,组织学变化有显著改善。结论:在高胆固醇血症大鼠的炎症反应中,伴有Rho激酶信号通路的激活;选择性Rho激酶抑制剂法舒地尔可阻断该通路,抑制NF-κB的激活和转位,进而影响炎症因子的产生,发挥抗炎作用;法舒地尔还可改善高胆固醇血症大鼠的脂质代谢紊乱。第二部分Rho激酶信号通路对高脂血症大鼠氧化应激的影响及法舒地尔的抗氧化作用研究目的:研究Rho激酶信号通路在高脂血症大鼠氧化应激中的作用及法舒地尔的抗氧化作用。方法:清洁级雄性SD大鼠40只,体重170～210 g,随机分成4组:正常对照组、模型对照组、法舒地尔低剂量及高剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠喂饲HCD,连续30 d。给予HCD14 d后,法舒地尔低、高剂量组分别给予法舒地尔10、30mg/kg/d,分两次腹腔注射给药,模型对照组腹腔注射给予生理盐水0.1 ml/kg/d,治疗共持续14 d。停药、停食24 h后,记录每只动物体重,然后断头取血,分离血清,留取心脏、肝脏,分别测定下列指标:(1)空腹血清TC水平;(2)血清抗氧化酶活性及一氧化氮(nitric oxide,NO)水平:抗氧化酶包括过氧化氢酶(catalase,CAT),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,Gpx);(3)Western blot测定心脏组织中p-MYPT1和一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达;(4)心脏组织中抗氧化酶活性及NO水平:制备心脏组织匀浆,分别测定CAT、SOD和Gpx的活性和NO水平;(5)心脏指数和心脏组织病理学检查:称取整个心脏重量,计算心脏指数=心脏重量/体重;切取部分心脏组织做常规HE染色,观察心脏组织炎症变化;(6)肝脏指数和肝脏组织病理学检查:称取整个肝脏重量,计算肝脏指数=肝脏重量/体重;切取部分肝脏组织做常规HE染色,观察肝脏组织学变化。结果:1血清TC水平:与正常对照组相比,模型对照组TC水平明显增高(P<0.05);与模型对照组相比,法舒地尔治疗明显降低了TC水平(均P<0.05),但未达正常水平。2血清抗氧化酶活性:与正常对照组相比,模型对照组抗氧化酶CAT、SOD和Gpx的活性均有显著降低(均P<0.05);两个剂量的法舒地尔治疗均极大地提高了CAT、SOD和Gpx的活性(均P<0.05)。3心脏组织中p-MYPT1水平的变化:在模型对照组大鼠的心脏组织中,p-MYPT1水平明显高于正常对照组(P<0.05);而经两个剂量的法舒地尔干预,其水平得到明显抑制(均P<0.05)。4心脏组织中抗氧化酶活性:与血清检测结果相似,与正常对照组相比,模型对照组心脏组织内抗氧化酶CAT、SOD和Gpx的活性均有显著降低(均P<0.05);两个剂量的法舒地尔显著提高了CAT、SOD和Gpx的活性(均P<0.05)。5血清和心脏组织中NO及心脏组织中eNOS表达的变化:模型对照组大鼠血清和心脏组织内的NO水平,均明显低于正常对照组(均P<0.05);与模型对照组相比,法舒地尔两个剂量组大鼠血清和心组织内的NO水平均有显著提高(均P<0.05)。模型对照组大鼠心脏内eNOS表达水平明显低于正常对照组(P<0.05);经法舒地尔干预后,eNOS表达量显著提高(均P<0.05)。6心脏、肝脏指数及组织病理学检测:各组之间心脏指数未见明显差异;心脏组织学检查:肉眼观察,各组之间未见明显差异。镜下观察,模型对照组大鼠心肌细胞增粗,间质内结缔组织增多,并有组织水肿;法舒地尔治疗组大鼠,心肌细胞肿胀和间质内组织水肿均有明显改善。与正常对照组相比,模型对照组肝脏指数有明显增高(P<0.05);法舒地尔治疗组与模型对照组相比,肝脏指数明显降低。肉眼观察,正常对照组大鼠肝脏颜色鲜红,表面光滑,质脆柔软;模型对照组大鼠肝脏明显肿大,并呈黄褐色,触之有油腻感,而法舒地尔治疗组肝肿大减轻,颜色较红。镜下观察,模型对照组大鼠有明显的肝细胞脂肪变性,肝细胞体积增大,胞浆内有弥散分布的空泡状脂滴,严重者融合为大脂滴,将细胞核推向一侧;汇管区见少量炎细胞浸润。法舒地尔治疗后,肝细胞脂肪变性程度明显减轻,胞浆内脂滴明显较少。结论:Rho激酶活性在高脂血症大鼠心脏组织内明显增高,介导了氧化应激和内皮功能的损伤;Rho激酶抑制剂法舒地尔可通过抑制该通路的激活,提高机体的抗氧化能力并改善内皮功能。第三部分Rho激酶信号通路对氧化型低密度脂蛋白诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响目的:研究Rho激酶信号通路对氧化型低密度脂蛋白诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响方法:采用组织贴块法分离培养大鼠主动脉VSMC,取4～6代细胞用于实验。用法舒地尔(0.1、1.0及10μM)预孵细胞1小时后,给予ox-LDL(50 mg/L)刺激至24 h。采用MTT法检测VSMC增殖活性;上清液检测SOD、MDA含量;用Western blot检测细胞内基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2和MMP-9蛋白的表达量。结果:给予ox-LDL(50 mg/L)刺激,VSMC细胞增殖活性显著提高,MMP-2和MMP-9蛋白表达量增多,上清液中SOD含量下降,而MDA水平增高;用0.1μM的法舒地尔预处理除使MMP-2表达降低外,未明显改变上述其他指数,1μM和10μM的法舒地尔预处理,可显著抑制VSMC的增值活性,减少MMP-9和MMP-2蛋白表达,提高SOD活性,降低MDA含量。结论:Rho激酶信号通路介导了ox-LDL所诱导的VSMC增殖,抑制该通路可提高VSMC的抗氧化能力、下调MMP2和MMP-9蛋白的表达,从而抑制VSMC的增殖。结论1在高脂血症大鼠的炎症反应和氧化应激状态中伴有Rho激酶信号通路的激活,并与内皮功能紊乱有关。2选择性Rho激酶抑制剂法舒地尔可阻断Rho激酶信号通路,影响NF-κB的激活和转位发挥抗炎作用,并可改善脂质代谢紊乱;法舒地尔还可提高机体的抗氧化能力并改善内皮功能。3在氧化型低密度脂蛋白诱导的VSMC增殖过程中伴有Rho激酶信号通路的激活;抑制该通路可通过提高VSMC的抗氧化能力及下调MMP-2和MMP-9表达而抑制VSMC的增殖。