研究背景与目的乳腺癌是一种由于乳腺导管和乳腺小叶内细胞增殖和分化异常引起的恶性肿瘤,它包括多种亚型,而且每种亚型的治疗条件和预后都不一样。乳腺癌多见于发生在女性人群,少数发生在男性,多数呈现一种散发的趋势,少数具有遗传的倾向。乳腺癌每年大约有一百万新生的病例,是女性最常见的恶性肿瘤。在发达国家,乳腺癌的患病率占所有癌症病例的10%,占所有女性癌症患者的23%。目前女性罹患乳腺癌风险的概率增加一倍以上,而有乳腺癌家族史的女性患乳腺癌的风险更高。在过去20年间,乳腺癌的死亡率总体上有所下降,但是一些类型的乳腺癌无法用常规方法治疗,特别是ERa/PR/HER2都是阴性的乳腺癌(三阴性乳腺癌)。在女性发生乳腺癌病例中15-25%是三阴性乳腺癌,并且这种类型预后往往是最差的,因为三阴性乳腺癌对传统治疗手段和HER2靶向治疗不敏感；另外该种类型乳腺癌3-5年复发率很高,是导致预后不良的另外一个因素。正是由于这些因素的存在,越来越多的研究人员希望通过新的途径来治疗三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌的研究进展还在初级阶段,而患者预后特别差,急需寻找一种新的,行之有效的治疗手段。其中化疗是一种重要手段,ML264是一种新型的药物,它是KLF5/EGR1抑制剂,通过靶向一些重要基因而下调KLF5,能有效抑制体内和体外结直肠癌细胞的增殖,是一种新的肿瘤化疗药物和靶向药物。然而我们发现,ML264对乳腺癌治疗效果不如在结直肠癌的好,需要一个较高的抑癌药物浓度。因此,我们和美国病理和毒理学研究所的周佳教授合作,帮助合成了ML264衍生物YD277。YD277是一个全新的小分子化合物,在体外实验中,它能有效抑制大多数类型乳腺癌细胞系的生长,尤其是对三阴性乳腺癌增殖抑制效果明显。其优点是它对正常细胞MCF10A杀伤能力较小,动物实验显示YD277能有效抑制乳腺癌移植瘤生长,并且毒性小,对小鼠主要器官影响不大。我们研究发现,YD277是通过ER-STRESS激活Caspase3,进而引起肿瘤细胞凋亡。其中IREla是不可或缺的基因,在激活凋亡中扮演重要角色。在细胞水平,YD277浓度2-3gM能有效杀伤大多数乳腺癌,抑制生长,诱导凋亡。在动物实验中,化合物YD277在浓度15mg/Kg能有效抑制移植瘤(三阴性乳腺癌细胞)生长。因此YD277很可能成为有效治疗三阴性乳腺癌的新药物。本课题主要通过体内体外各种生物学方法,探究YD277的抑癌效果和机制,并且为三阴性乳腺癌的治疗提供新化疗药物和方向。方法1.SRB法检测细胞生存率,反应药物抑制癌细胞效果。首先得到ML264衍生物24个,以10gM浓度在细胞系HCT116, MDA-MB-231, HCC 1806进行处理48小时,镜下可见大量漂浮变圆的凋亡细胞。甩干培养基后经过TCA固定,晾干,SRB染色,1%冰醋酸洗脱晾干,10mM Tris base溶解处理,酶标仪检测吸光值,筛选出有效的抑癌药物YD277。使用潜在抑癌药物YD277以不同的浓度在MCF10A,MCF7,T47D,SUM149PT, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, Hs 578t, HCC 1806, HCC 1937,十株细胞系验证抑癌效果,再次使用SRB的方法测定准确每株细胞系准确的IC50。最后根据实验需要选出MDA-MB-231, MDA-MB-468作为研究的代表细胞系,作为后续实验的材料。2.EdU检测细胞增殖为了检测药物YD277影响细胞增殖情况,使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系,以不同浓度YD277(0,3,10μM)处理24小时,以ML264(10μM)作为对照,然后用Click-iT EdU试剂盒进行处理,最后封片拍照,所得结果用ImageJ和IPP软件处理,从每个处理结果中选择3张图片,从中选取10个区域进行统计,所得比值作为最后结果。3.细胞凋亡分析为了论证YD277引起细胞增殖减少的原因,我们使用流式方法检测药物YD277引起细胞凋亡情况。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468铺板,用YD277不同浓度(0,1,3, 10μM), ML264(10μM)作为对比,处理36小时后胰酶消化,每个细胞系分出三个对照组。离心去上清,用700ul Anti-Annexin V Binding buffer洗两次,之后分别用Annexin V避光染色30 min,离心,700 ul Binding buffer洗两遍,PI染色,直接AccuriC6 (BD)上机分析凋亡比例。4.细胞周期试验为了论证YD277引起肿瘤细胞增殖减少机制,我们使用流式方法检测该药物对细胞周期阻滞的影响。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系进行铺板,然后用YD277不同浓度(0,1,3,10μM)处理36小时,胰酶消化,用PBS洗两次,离心去上清。最后以大约6x105个细胞用200ul PBS+0.6%NP40+1ul PI+2 ul RNase的比例配成体系,重悬细胞。染色处理20 min,37℃,避光。Accuri C6 (BD)上机分析细胞周期,软件FlowJo分析结果。5. 蛋白印迹检测一般周期和凋亡相关的蛋白的改变,用以探索凋亡机制。为了探讨细胞周期和凋亡改变的机制,我们做了大量蛋白筛,使用MDA-MB-231和MDA-MB-468用不同浓度YD277 (0,1,3, 10μM)处理36小时,用细胞裂解液裂解,4℃,30 min,离心,蛋白定量,然后加4XSDS Loading Buffer,100℃ 5min煮样,上样,跑胶分离蛋白,转膜,各种抗体孵育14小时,二抗孵育2小时,曝光仪检测检测各个目标条带变化情况。使用Photoshop作图软件进行数据处理。6. ER-STRESS通路探讨和验证经过筛查细胞凋亡通路蛋白,发现内质网积压通路蛋白有明显变化。尤其是TRAF-ASK-IRE1α通路变化显著。在10cm培养皿种板MDA-MB-231和MDA-MB-468,贴壁后瞬时转染siBIP, silRE1a, siJnk (total) 50nM浓度,24小时后消化,种板到48孔板。次日以多个浓度YD277 (0.3-12μM)处理48小时,SRB检测细胞增殖情况,计算比较IC50的改变。结果发现敲除IRE1α后,耐药性显著增加(IC50从1.5μM升到10μM)。使用siIREla 50nM在MB-231和MB-468两个细胞系敲除IREla24小时后,加药YD277 10μM处理36小时,以DMSO组和siLuc组作为对照。收集蛋白检测各组IREla激活状态。收集细胞流式检测细胞凋亡状态。通过该实验明确YD277诱导凋亡的途径和机制。7.动物实验检测药物体内抑癌活性,对评价药物作用有重要价值。购买4周龄雌性裸鼠,养一周适应新环境后,用MDA-MB-231细胞系,按单侧1X106,进行双侧成瘤,一周后肿瘤生长均匀,当肿瘤体积达到1 0mm3进行随机分组。分成安慰剂组8只小鼠,YD277 15mg/Kg处理组8只小鼠,YD277 25mg/Kg处理组10只。阳性对照组(盐酸表柔比星8mg/kg每两天一次)4只小鼠作为实验技术性对照。以每隔一天腹腔注射给药,处理时间20天。当肿瘤直径接近1cm时出现缺血溃疡,终止实验。剥取肿瘤测量重量,拍照。半小时内细胞固定液处理48小时后进行免疫组化检测。取主要器官进行称重,HE染色确定药物毒性。该实验的目的是评价药物YD277在活体的治疗作用和毒理作用。8.蛋白Pulldown实验和质谱鉴定为了探讨YD277更明确的抑癌机制,其直接靶点需要更加明确。为了实现这个目的,周佳实验室合成了Biotin-YD277,用Streptavidin-Beats混合,加入到MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞裂解液中,4℃孵育,离心,然后经过蛋白分离,胶块银染,得到潜在的YD277靶向蛋白。把所得的蛋白样品送到上海周虎实验室,进行蛋白质谱鉴定。9.数据处理为了保证数据的准确性,实验数据进行至少三次独立重复的验证。动物实验使用尽可能多的成瘤个数,测量的数据将以Mean±标准差表示,使用软件SPSS运算t检验进行显著性分析,P值<0.05则认为有显著性差异。流式结果使用FlowJo处理,柱形图和线形图使用GraphPad Prism version 5.0制作。Edu结果使用ImageJ, IPP进行重叠计数。结果和讨论1.通过SRB实验检测细胞增殖率,以HCT116, MDA-MB-231, HCC 1806三株结直肠癌和乳腺癌细胞作为筛选细胞系,从24个ML264衍生物中筛选出YD277作为潜在有效的研究药物。然后以该药物多个浓度在多个细胞系MCF10A, MCF7, T-47D, SUM 149PT, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, Hs 578t, HCC 1806, HCC 1937十株细胞系测定各自准确IC50并且绘制细胞存活率曲线,我们发现YD277对大多数乳腺癌细胞有较好的抑制作用,但对正常乳腺上皮细胞系MCF10A抑制作用小很多(HC11和NIH3T3抑癌浓度为15国μM和30μ M,结果未展示),癌细胞对这个药物更加敏感,YD277是一个很有可能成为新的抗肿瘤新药,因此需要充分研究该药物的抑癌机制和抑癌效果。通过细胞系筛查,我们得到MDA-MB-231和MDA-MB-468的IC50在1.5-3μM之间。由于我们倾向研究三阴性乳腺癌的研究,并且MDA-MB-231易于活体成瘤,所以选择这两个细胞作为研究细胞系,作为进行后续各项实验的材料。2.EdU细胞增殖实验显示,YD277显著抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468的DNA合成,减少细胞分裂,证明细胞增殖受到抑制。我们通过EdU实验发现,用不同剂量的YD277(0,3,10μM)和母合药物ML264 (10μM)作为对照,处理24小时后,检测发现两株癌细胞在YD277作用下,DNA合成能力显著下降,细胞分裂减慢,细胞增殖显示出随药物浓度增加梯度下降。母合结构ML264在24小时的处理时间不能显著减少DNA合成。肿瘤细胞增殖减少原因可能是多方面的,方面可能是细胞周期受到阻滞,导致细胞分裂减少。另一方面也可能是因为细胞凋亡增多导致。因此,我们希望通过流式检测细胞周期阻滞和细胞凋亡情况来研究这个药物抑癌机制。3.流式凋亡实验证明,YD277明显导致MDA-MB-231和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌凋亡细胞比例增加。通过以不同剂量的YD277处理(0,1,3,10μM),母合药物ML26410μM作为对照,处理36小时后,镜下可见药物处理细胞系明显变形,漂浮,可见凋亡细胞。然后MDA-MB-231和MDA-MB-468分别用PI和Annexin V双染,流式检测凋亡比例。结果显示随着YD277浓度的升高,两株细胞的早期凋亡和晚期凋亡的比例显著升高,显示剂量效应。10μM高浓度组超过阴性对照组的15%,凋亡效果明显。而母合药物ML264不能显著引起乳腺癌细胞凋亡。这说明YD277部分通过诱导细胞凋亡影响细胞增殖。4.流式周期检测显示,YD277明显导致MDA-MB-231和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌G1期阻滞,抑制肿瘤细胞的生长。通过不同剂量的YD277 (0,1,3, 10μM),以母合药物ML264 (10μM)作为阳性对照进行对比,药物处理36小时,然后流式检测细胞周期,发现随着药物浓度的提高,YD277显著引起G1期阻滞。结果跟镜下显示一致,因为YD277不仅导致细胞凋亡,还能导致细胞分裂减少,这可能部分是由于周期阻滞造成的。5.使用蛋白印迹实验经过大量通路筛查表明,YD277明显导致三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468一系列周期,凋亡和一些细胞信号通路蛋白的变化。通过不同剂量的YD277 (0,1,3, 10μM)和母合药物ML264 10μM处理36小时后,用细胞裂解液处理细胞,收蛋白。用西部印迹方法检测相关蛋白变化,发现凋亡相关蛋白PARP, C3有显著的切割带,细胞增殖存活相关蛋白BCL2, MCL-XL, Survivin显著下降,自噬蛋白LC3B显著性升高。阻滞周期蛋白P21,P27显著性升高,而促进细胞周期蛋白CD1显著下降。这些结果和流式结果是一致的。为了探索YD277引起凋亡的方式,我们通过筛选凋亡三大经典途径的大多数蛋白,发现ER-STRESS凋亡通路的蛋白有显著性变化,比如蛋白Bip, IRE1α, p-Jnk, p-C-Jun, CL-c3有显著性变化,提示YD277可能部分通过诱导ER-STRESS介导细胞凋亡。6.药物YD277可以部分通过ER-STRESS诱导肿瘤细胞凋亡。为了验证这个观点,使用瞬时转染的方法,敲低基因Bip, IRE1α, Jnk (total) 24小时后,重新铺板贴壁后,以不同浓度YD277处理,发现当敲低IRE1α后,IC50显著性升高(10μM),而敲除Bip和tJnk后,挽救效果不如敲低IRE1α。该实验说明,IRE1α在YD277导致的细胞凋亡过程中发挥重要作用。我们进一步验证敲除该基因后,细胞凋亡情况和蛋白水平状态,发现若敲除IRE1α后,YD277不能激活ER-STRESS和介导凋亡效果。本实验证明YD277是通过ER-STRESS诱导肿瘤细胞凋亡,但是YD277具体是如何诱导IRE1α的机制尚不得知,需要依靠蛋白Pulldown实验来探索。7.动物实验表明,YD277能有效抑制小鼠体内移植瘤生长。经过每隔一天,腹腔给药28天的方式处理荷瘤裸鼠之后,我们发现与安慰剂相比,药物YD277在浓度15mg/Kg和25mg/Kg两组能显著抑制活体移植瘤(MDA-MB-231)的生长,药物吸收良好。对小鼠的体重影响没有显著性差异。动物实验有效说明经过动物体循环之后,药物效果没有发生很大变化,抑癌效果依然显著。8.将Biotin-YD277和Streptavidin-Beats Pulldown之后,银染所得到的蛋白进行质谱分析,可以得到大量潜在发挥功能的蛋白。后期将通过验证这些蛋白是否为YD277的靶蛋白,探讨它们是如何诱导IRE1a激活ER-STRESS的。结论YD277是一个新型的,能有效抑制三阴性乳腺癌增殖的小分子化合物。在体外实验中,YD277在1.5-3μM的处理浓度能有效抑制大多数乳腺癌细胞系增殖,导致周期阻滞在G1期,减少细胞分裂,诱导凋亡。然而它在这个浓度不影响正常乳腺上皮细胞系MCF10A生长。生物学实验和蛋白印迹实验证明YD277能有效导致细胞凋亡。其导致凋亡部分是通过诱导ER-STRESS,激活IRE1a蛋白来实现的,但是具体YD277是如何介导ER-STRESS的发生还有待进一步探索。在体内试验,药物浓度为15mg/Kg的YD277能有效抑制移植瘤(三阴性乳腺癌)的生长,对小鼠机体影响小,主要器官变化不大,其毒性显著低于临床常规治疗药物表柔比星。因此,YD277是一个值得研究的,有望成为下一代临床治疗乳腺癌的新化疗药物,并且为三阴性乳腺癌抑癌机制提供新思路。