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第一部分未折叠蛋白反应相关关键蛋白在顺铂致大鼠耳蜗细胞毒性损伤过程中的表达及变化情况目的:建立顺铂耳中毒性聋大鼠模型,观察未折叠蛋白反应相关关键蛋白在顺铂致大鼠耳蜗细胞毒性损伤过程中的表达及变化情况,并分析其意义。方法:选取180-200g的雄性Sprague-Dawley大鼠,连续3日给予顺铂4.6mg/kg/d腹腔注射,给药前后分别进行听性脑干反应(ABR)检测,比较用药前后大鼠听阈(ABR反应阈)的变化。于末次ABR检测后处死大鼠并收集耳蜗标本。通过TUNEL法及免疫印迹法检测大鼠耳蜗组织中的细胞凋亡情况。应用免疫荧光法检测大鼠耳蜗组织中GRP78及CHOP的表达变化,并分析未折叠蛋白反应及其相关凋亡在顺铂致大鼠耳蜗细胞毒性损伤过程中的作用及意义。结果:1.与对照组相比,顺铂组大鼠出现了明显的听力损伤(p<0.05)。2.顺铂使大鼠耳蜗组织中的多种细胞成分发生凋亡,其中以外毛细胞、血管纹边缘细胞和前庭膜细胞最为显著。3.顺铂耳中毒性聋大鼠的耳蜗组织中,GRP78、CHOP、cleaved-caspase-12及cleaved-caspase-9的表达水平较对照组均有所升高,而总泛素化蛋白的表达水平则较对照组有所降低,差异均具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.顺铂对大鼠的听力造成了明显的损伤,大鼠耳蜗组织中的多种细胞发生了凋亡,顺铂耳中毒性聋大鼠模型成功建立。2.依赖线粒体的内源性凋亡信号可能参与了顺铂致大鼠耳蜗细胞毒性损伤的发生,而强烈的未折叠蛋白反应可能是这种凋亡信号被激活的原因之一。3.大鼠耳蜗细胞中蛋白质的泛素化降解过程可能受到了顺铂的干扰,这可能是耳蜗细胞中蛋白质稳态被顺铂破坏并触发未折叠蛋白反应的原因之一。第二部分牛磺酸熊去氧胆酸通过调节未折叠蛋白反应减轻顺铂对听毛细胞的毒性损伤目的:分别选用HEI-OC1细胞株及SD大鼠建立顺铂对听毛细胞损伤的细胞及动物模型,并在上述模型中采用内质网蛋白质稳态促进剂牛磺酸熊去氧胆酸(TUDCA)进行干预,观察TUDCA对顺铂致听毛细胞毒性损伤的影响,并初步探讨未折叠蛋白反应在其中发挥的作用。方法:1.体外实验:选用状态良好的HEI-OC1细胞株,分为对照组、TUDCA组、顺铂组及顺铂+TUDCA组。于造模终点收集细胞,采用CCK-8法检测组间细胞存活率的差异,运用流式细胞术检测组间细胞凋亡比例的差异,通过透射电镜观察各组细胞中亚细胞结构的形态变化,应用免疫印迹技术检测组间GRP78及CHOP表达水平的差异。2.体内实验:选用健康雄性SD大鼠并随机分为对照组、TUDCA组、顺铂组及顺铂+TUDCA组。应用ABR法检测各组大鼠间听阈(ABR反应阈)阈移的差异。提取耳蜗标本,部分标本经显微解剖后进行基底膜铺片并外毛细胞计数,分析各组大鼠间耳蜗底回同一部位外毛细胞死亡数量的差异;另一部分标本制成石蜡切片通过免疫荧光法比较各组大鼠间耳蜗底回外毛细胞中GRP78及CHOP表达水平的差异。结果:1.体外实验:与对照组相比,顺铂组HEI-OC1细胞的存活率下降,凋亡比例增加,透射电镜下可见顺铂组细胞中的部分内质网扩张,部分线粒体出现肿胀及空泡化,而TUDCA的加用使顺铂的上述细胞毒效应得到部分逆转;与顺铂组相比,顺铂+TUDCA组细胞中GRP78及CHOP的表达水平有所下降,差异均具有统计学意义(p<0.05)。2.体内实验:与对照组相比,TUDCA组大鼠的听力在给药前后无明显变化(p>0.05),顺铂+TUDCA组大鼠的听力损伤轻于顺铂组;TUDCA的加用降低了耳蜗底回外毛细胞中GRP78及CHOP的表达水平,同时提升了顺铂作用下外毛细胞的存活率,差异均具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.TUDCA本身无明显耳毒性。2.TUDCA在细胞及动物水平均可减轻顺铂对听毛细胞的毒性损伤。3.TUDCA减轻顺铂致听毛细胞毒性损伤的作用可能是通过调节未折叠蛋白反应及其相关凋亡来实现的。