白血病是儿童最常见的造血系统恶性肿瘤,化疗是当前主要的治疗方法。白血病化疗失败的主要原因之一是多药耐药(multidrug resistance, MDR)的发生,尤其在儿童急性髓细胞白血病(AML)中更为突出。而且多药耐药的发生严重限制患儿长期无事件生存率。因此,揭示MDR的发病机制,寻找新的治疗十预靶点,对于防治儿童白血病具有重要意义。WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP-family verprolin homologous protein 1, WAVE1)为肌动蛋白调节蛋白,在肌动蛋白聚合和细胞骨架重排中发挥重要作用。项目组前期研究中发现WAVE1是白血病细胞中一新型抗凋亡蛋白,并与白血病K562／A02细胞系的多药耐药发生密切相关。本研究首先收集AML患儿的BMMCs,通过实时定量PCR和蛋白印迹方法(Western blotting)对52例AML患儿骨髓单个核细胞(BMMCs)中WAVE1、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白1(Multiple resistance-associated protein-1, MRP1)、肺耐药蛋白(lung-resistance related protein, LRP)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的表达情况进行了检测。研究结果显示复发／难治组AML的WAVE1及耐药相关基因表达水平显著高于缓解组患儿,而且同一患儿初治及复发时的WAVE1基因表达水平明显高于缓解期,表明WAVE1表达水平与AML的预后和疾病活动程度相关。进一步利用白血病HL60,K562及其耐药细胞系,分析了WAVE1对P-gp、MRP1和BCRP表达的影响。研究发现WAVE1能够增加K562细胞系P-gp的表达,HL60细胞系MRP1和BCRP的表达。相反,采用RNA干扰技术降低K562／A02和HL60／ADR耐药细胞系中WAVE1的蛋白表达,能显著下调这些细胞系中耐药相关基因P-gp, MRP1和BCRP的表达水平。为进一步探讨WAVE1影响P-gp等耐药相关蛋白表达的机制,本研究以WAVE1蛋白为诱饵,采用抗WAVE1抗体免疫沉淀白血病细胞中的WAVE1结合蛋白,然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对含有WAVE1结合蛋白的复合物进行分离,最后采用电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)结合数据库查询鉴定白血病细胞中WAVE1的结合蛋白,提示WAVE1与埃兹蛋白(Ezrin)存在结合。同时通过质谱分析,发现和鉴定了白血病细胞中43个可能与WAVE1具有直接结合的蛋白质,这些蛋白主要包含了肿瘤相关蛋白、细胞骨架蛋白、受体、代谢相关酶、免疫相关蛋白、膜及离子通道蛋白和信号通路蛋白。为进一步证实WAVE1-Ezrin-P-gp之间的相互作用,本研究通过活细胞免疫荧光技术证明了WAVE1和Ezrin存在空间位置上的共分布。通过基因转染和干扰技术,发现K562细胞转染WAVE1基因后可使Ezrin及P-gp表达升高,同时降低了K562细胞对阿霉素(ADM)的敏感性；而在高表达WAVE1的同时,沉默Ezrin基因的表达,P-gp水平并不能明显增加,而且K562细胞对ADM的耐药性也没有明显改变,表明WAVE1对P-gp表达的影响主要是通过Ezrin介导。在降低Ezrin表达的同时,白血病细胞系中WAVE1表达并不能明显降低,进一步提示Ezrin为WAVE1的下游效应蛋白,而不是WAVE1上游调控蛋白。因此,WAVE1对白血病细胞耐药性的影响主要是通过Ezrin来完成的。最后,本研究通过免疫磁珠分选出白血病细胞系和AML患儿BMMCs中的CD34阳性(CD34+)和CD34阴性(CD34-)细胞,通过Western blotting分析发现CD34+细胞的WAVE1表达水平明显高于CD34-细胞,提示WAVE1可能参与了造血干细胞的分化成熟与白血病干细胞的恶性克隆。综上所述,细胞骨架调节蛋白WAVE1参与了儿童AML发病及多药耐药的形成,WAVE1可能通过多个途径影响AML耐药的形成,其中WAVE1-Ezrin-P-gp信号通路为其重要的作用机制。同时,WAVE1可能与白血病干细胞的增值、分化相关。本研究揭示了WAVE1调控儿童AML多药耐药的作用机制,为寻找逆转白血病的多药耐药靶点提供了新线索和实验依据。