鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),是一种重要的条件致病菌,能够在医院各种医疗器械以及人体内生存并引起多种感染性疾病,病死率高。在部队伤员中的感染率也很高。近年来,鲍曼不动杆菌由于多重耐药和泛耐药越发普遍,被美国感染性疾病协会列为给医疗卫生服务系统造成巨大挑战的七大病原菌之一。在我国,鲍曼不动杆菌临床分离率居前5名,耐药形势也日益严峻,给感染防治造成了极大的困难。密切监测和分析鲍曼不动杆菌的耐药性及遗传多态性,有助于有针对性地提出治疗策略,提高治疗效率。除耐药性强之外,鲍曼不动杆菌还是最常见的引起生物膜相关感染的病原菌之一。生物膜是细菌依附于载体表面形成的有细胞外基质包被的细胞间相互协调的微生物膜性结构。细菌形成生物膜后不仅耐药能力极大提高,还能逃避机体免疫作用,长期存活并引起慢性感染,严重危害人类健康。生物膜是细菌在体内外的主要存在形式,因此生物膜耐药能力在实际中更为重要。已有研究表明它能够达到细菌耐药能力的10-1000倍,极大地提高了治疗难度。生物膜和耐药是细菌的两大重要生存能力,研究二者之间的关系以及生物膜耐药能力的强度和影响因素,对深入理解细菌生物膜感染机制,寻找有效的防治方法具有重要意义,也是有效防控细菌感染的重要科学问题。这些问题虽然已有部分相关研究,但是至今还没有定论,所以本课题主要开展了以下几项研究。第一部分首先分析了2010-2013年间从北京和厦门两地临床感染患者样本收集的272株鲍曼不动杆菌的耐药能力和遗传多态性。从菌株对指定的九大类21种抗生素的耐药率看,耐药问题非常突出:对头孢类抗生素耐药率最高(98.2%),其次是青霉素类(90.8%)、四环素类(68.4%)、氟喹诺酮类(66.9%)、青霉素+β-内酰胺酶抑制剂类(65.4%)、氨基糖苷类(62.1%)、碳青霉烯类(59.9%)和叶酸代谢途径抑制剂类(59.9%),对脂肽类耐药率最低(3.7%)。多重耐药和泛耐药率高达72.4%。北京地区来源的菌株对除左氧氟沙星和多粘菌素B之外的全部抗生素耐药率均显著高于从厦门分离的菌株。从PFGE分子分型看,菌株遗传多态性高,但八个优势流行簇均由多重耐药菌和泛耐药菌组成,有的已经在北京和厦门两地流行。分析发现优势流行簇对阿米卡星、妥布霉素、米诺环素、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦五种抗生素中的一种或几种相对耐药性低,提示可以更加有针对性地选择抗生素治疗。MLST分析发现优势st型中大多为多重耐药和泛耐药菌。发现了53个新的st型,其中绝大多数为非多重耐药菌,说明非多重耐药菌变异率高。第二部分评价全部菌株的生物膜形成能力,比较生物膜形成前后耐药能力变化,分析细菌耐药能力、生物膜形成能力与生物膜耐药能力三者之间的关系。使用结晶紫染色法分析所有菌株的生物膜形成能力,并通过共聚焦激光扫描显微镜法验证。菌株的生物膜形成能力差异较大,od550在0.078±0.003到2.556±0.137之间。其中249株菌(91%)能够形成生物膜,63株(23%)生物膜形成能力强于atcc19606。比较生物膜形成能力不同的22株菌的生长曲线,发现细菌之间生长率没有显著差异。所以生物膜形成能力的差异不是由于细菌生长率差异。分析细菌耐药能力与生物膜形成能力的关系,发现二者之间存在负相关,即耐药性强的菌株形成生物膜能力弱,而敏感菌往往能够形成更强的生物膜。这初步说明鲍曼不动杆菌在形成生物膜和产生耐药这两大生存能力上存在互补。随后了解鲍曼不动杆菌形成生物膜后耐药能力的变化。利用系统抽样法,按照生物膜形成能力抽取31株菌,定量检测菌株对头孢噻肟、亚胺培南、环丙沙星三种抗生素最低抑菌浓度(mic)和最低生物膜清除浓度(mbec)。发现细菌在形成生物膜后对不同抗生素的耐药能力增长的幅度不同,对头孢噻肟,mic为0.5-1,024μg/ml,mbec为256-524,288μg/ml,增幅为8-2,048倍。对亚胺培南,mic为0.25-128μg/ml,mbec为8-4,096μg/ml,增幅为32-512倍。对环丙沙星,mic在0.25-256μg/ml,mbec为8-8,192μg/ml,增幅为16-512倍。将增幅与菌株的生物膜形成能力对比分析,发现二者之间无显著相关性。而对每一种抗生素而言,生物膜耐药能力与细菌耐药能力正相关,意味着对于多重耐药菌和泛耐药菌来说,尽管形成的生物膜往往很弱,然而一旦形成,还是能够极大地提高耐药能力,使得抗感染治疗的难度大大增加。在第三部分,针对上述发现的现象从生物膜形成相关基因、质粒图谱、crispr系统、持留菌和转录组分析五个方面对其中的机制进行初步探讨。首先对已报道的7个鲍曼不动杆菌生物膜形成相关基因(bap、bfs、abai、bfmr、bfms、csua、csuab)携带情况进行检测,发现其中的3个基因在不同耐药能力菌株中的分布有明显规律。bap基因在耐药性越强的菌株中阳性率越高,bfmr和bfms则在耐药性越强的菌株中阳性率越低。结合文献调研,发现bap基因编码的bap蛋白能够提高生物膜的耐药性,这就能够在一定程度上解释即使耐药菌只能形成少量的生物膜,耐药能力还是能够得到极大提升这一现象。bfmr和bfms的分布与我们发现的生物膜形成能力与细菌耐药能力负相关一致,另外还有文献指出bfms基因同样影响细菌对亚胺培南和环丙沙星的耐药能力,这一发现进一步提示生物膜形成相关基因与细菌耐药过程有关。在全部菌株中有255株能够检出质粒,数量为1-7个不等,大小在5.28-207.6kbp之间。统计分析发现耐药性强的菌株往往携带更多的质粒,但是未发现生物膜形成能力和质粒携带情况的关系。尽管文献报道质粒同时参与细菌耐药和生物膜的调控,但是单从质粒的携带情况看还不能解释本研究中发现的生物膜形成能力与细菌耐药能力负相关的现象,需要深入进行序列分析。CRISPR系统检测发现272株菌中仅有14株具有完整的CRISPR结构,还有一株发生大片段的替换。CRISPR系统阳性的菌株生物膜形成能力显著强于阴性菌。而且cas1和cas3基因在生物膜中表达上调,提示CRISPR系统有可能在生物膜中活跃。因为生物膜结构的物质交流通道有利于基因横向转移,所以CRISPR在生物膜中对耐药的调控作用可能比在游离菌中更强。选择涵盖了耐药敏感、生物膜形成能力最强最弱、生物膜耐药增幅最大最小、生物膜耐药能力最强最弱几个特点的7株菌进行持留菌比例分析,发现鲍曼不动杆菌生物膜中持留菌的比例在0.0001%-0.01%之间。耐药性强的菌株生物膜中持留菌比例略高于敏感菌生物膜,这能够解释即使耐药菌形成的生物膜稀疏斑驳,但是耐药增幅不低于敏感菌这一现象。选择对亚胺培南耐药和敏感的菌株各一株,对它们在游离菌、生物膜、亚胺培南刺激下的游离菌和亚胺培南刺激下形成的生物膜四个状态下进行转录组测序分析,发现细菌在抗生素刺激和形成生物膜的过程中有大量物质代谢发生变化,而且基因突变率提高,除此之外,鞭毛组装、ABC转运系统、I型和II型分泌系统通路基因都在这些过程中发生表达变化,说明它们都同时在鲍曼不动杆菌生物膜的形成与耐药过程中发挥作用。综上所述,本研究提出,鲍曼不动杆菌多重耐药和泛耐药率高,遗传多态性高,优势流行簇对阿米卡星、妥布霉素、米诺环素、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦五种抗生素中的一种或几种相对耐药性低。生物膜形成能力和细菌耐药能力存在负相关关系。生物膜耐药能力与细菌耐药能力正相关。形成生物膜后的耐药增幅与生物膜强弱未见明显关系,意味着很弱的生物膜也能够极大地提高耐药能力。这可能与bap基因和持留菌有关。CRISPR系统、鞭毛、ABC转运系统、I型和II型分泌系统等也有可能参与生物膜耐药的调控。这些发现提示可以更加有针对性地选择抗生素治疗,而且加强了对鲍曼不动杆菌生物膜感染的认识,为控制和治疗相关感染提供了参考和借鉴。