檀香烯醇类物质生物合成分子机制的研究

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檀香(Santalum album)是檀香科(Santalaceae)檀香属(Santalum)常绿根寄生小乔木,因其芳香的心材和心材蒸馏得到的精油而具有极高的价值。檀香心材和精油的主要成分是倍半萜类物质,即(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇。倍半萜类物质主要通过胞质中的MVA途径合成,TPSs和CYP450s是合成过程中的关键酶;MEP途径主要合成单萜和二萜,DXS和DXR是MEP途径中的限速酶;MEP与MVA途径之间存在相互交流。本文围绕SaDXS与SaDXR对檀香倍半萜类物质合成的影响以及SaCYP736A167转录调控机制的研究而展开,并取得了以下的研究成果:  1.通过RT-PCR和RACE的方法,克隆SaDXR、SaDXS1A和SaDXS1B。生物信息学分析表明:SaDXS1A和SaDXS1B具有DXS家族成员共有的硫胺素焦磷酸结合位点和吡啶结合DRAG结构域;SaDXS1A和SaDXS1B同属于合成初生代谢产物(如叶绿素和类胡萝卜素等)前体的DXS I亚家族。SaDXR具有DXR家族共有的富含脯氨酸的结构域(PPPAWPGR)和保守的NADPH结合域(GSTGSIGT)。通过FPNI-PCR技术获得SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR的启动子序列,同时瞬时表达烟草叶片验证了SaDXS1A与SaDXS1B启动子的活性。qRT-PCR分析表明:SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR在檀香根、花、茎干边材、茎干心材、叶和嫩枝中均有表达,其中SaDXS1A在花中表达量最高,SaDXS1B与SaDXR在叶片中表达量最高。黄化檀香幼苗见光实验中,SaDXS1A、SaDXS1A和SaDXR表达量均在6h时有显著增高。亚细胞定位结果显示:SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR蛋白均定位在叶绿体上。SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR响应MeJA和ETH的刺激。分别构建SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR超表达载体转化拟南芥进行功能验证。与野生型拟南芥相比,SaDXS1A、SaDXS1B和SaDXR转基因株系中叶绿素和类胡萝卜素含量显著升高。异恶草酮和磷胺霉素处理檀香幼苗实验结果暗示:SaDXR可能还参与檀香醇的合成。  2.通过Tail-PCR扩增SaCYP736A167启动子序列。借助启动子转基因烟草植株和启动子瞬时表达烟草叶片与檀香愈伤组织体系,进一步GUS染色确定了SaCYP736A167启动子的活性。启动子顺式元件预测分析结合截断实验结果显示:SaCYP736A167启动子转录起始位点上游-212bp~-1bp在转录中起重要作用,这一序列中含有GCC-like box和G-box等顺式作用元件。基于转录组数据共表达分析、RT-PCR和RACE的方法,筛选并克隆SabHLH3和SaEBP转录因子。qRT-PCR验证了SaEBP与SaCYP736A167具有相似的表达模式,即心材中表达量高、边材和根中相对较低。而SabHLH3在各组织中表达量较为一致。亚细胞定位结果表明:SabHLH3和SaEBP蛋白均定位于细胞核。SabHLH3表达量受MeJA的诱导而增加;SaEBP的表达量在ETH处理下也有所升高。转录激活实验证明SaEBP具有转录激活活性。随后的酵母单杂实验和瞬时共表达实验证明:SaEBP与SaCYP736A167启动子存在结合。通过瞬时共表达和转录激活的结果,我们推测SabHLH3可能作为一个转录抑制因子调控SaCYP736A167的表达。
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