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冠状病毒属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。自上世纪90年代以来,多种冠状病毒的跨物种传播事件导致了重大的动物和人类疾病,冠状病毒越来越影响人类及畜牧业的健康,造成了不可估量的损失。2019年12月,冠状病毒在不到一个月的时间内席卷了整个中国,随后在世界范围内蔓延开来。截至2021年3月18日,全球已有121674944人感染,累计死亡人数超3000万,冠状病毒病毒已不止一次对人类社会造成如此巨大的危害及经济损失,2002年末在中国广东省首次报道的严重急性呼吸道综合症（SARS）,在积极的公共卫生干预策略成功遏制之前,已感染了8,000多人,并造成829人的死亡。而在2012年9月WHO发现的另一种病毒——MERS-CoV,可以导致急性呼吸综合征和肾功能衰竭,至今也严重危害着人类生命安全。动物作为中间宿主在冠状病毒的传播中发挥重要作用,使病毒能够从自然宿主传播到人类,了解各类动物中冠状病毒的多样性对于更好地预防突发公共卫生事件至关重要,因此对动物类冠状病毒监测是必不可少的一步。本研究旨在实时监测α、β属冠状病毒在动物中的分布和流行状况,为动物中α、β属冠状病毒可能引发的传染病提供预警。为建立能准确检测并用于临床的α-CoV和β-CoV实时荧光定量PCR（RT-q PCR）方法,本研究参考已公布的27株α-CoV序列及36株β-CoV全基因序列,分别设计简并引物,优化PCR反应条件,结果显示相关的最优反应条件为α-CoV特异性引物浓度为2μmol/L、退火温度为55℃;β-CoV特异性引物浓度为2μmol/L、退火温度为55℃,建立了一种能快速、准确检测α-CoV和β-CoV的实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,在10种常见危害畜禽生产的常见病毒中,只能检出α属的PEDV和TGEV。检测α-CoV的RT-q PCR相应标准曲线为:y=-3.9114x+43.779,相关系数为0.998,α-CoV最低检测限度为1.0×102copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的100倍。检测β-CoV的RT-q PCR相应标准曲线为:y=-3.8821x+44.73,相关系数0.993,最低检测限度为1.0×103copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的1000倍。重复性试验结果显示,α-CoV变异系数不高于2.0%,β-CoV变异系数不高于2.5%。本研究先后采集秋季样本515份,冬季样本428份样品,样品包括家畜（猪、牛、羊、驴）,毛皮动物（水貂、貉子、狐狸、兔）,试验动物（小鼠、豚鼠、兔）,动物园野生动物（大猩猩、熊猫、狮、虎、大象等）,宠物（狗、猫）。使用建立的实时荧光定量PCR方法对采集的943份样品进行了检测,其中秋季样品中,家畜ɑ-CoV阳性率为2.6%,β-CoV阳性率为5.2%;毛皮动物ɑ-CoV阳性率为4.2%,β-CoV阳性率为2.8%;实验动物ɑ-CoV阳性率为1.4%,β-CoV阳性率为7.0%;野生动物ɑ-CoV阳性率为2.1%,β-CoV阳性率为17.0%;宠物ɑ-CoV阳性率为14.3%,β-CoV4.3%。冬季样品中,家畜样ɑ-CoV阳性率为3.8%,β-CoV阳性率为3.4%;实验动物ɑ-CoV阳性率为4.3%,β-CoV阳性率为4.3%;野生动物ɑ-CoV阳性率为3.8%,β-CoV阳性率为23.1%;宠物ɑ-CoV阳性率为11.1%,β-CoV阳性率为1.0%。从检测结果综合看来,不论秋季还是冬季,动物园野生动物中β-CoV的检出率均比较高,表明野生动物更易感β-CoV,可能是多种β-CoV的宿主或中间宿主,应加强其β-CoV的监测。由于野生动物粪便中β-CoV的检出率比较高,选取其中三份强阳性样品送上海探普生物有限公司进行宏基因组测序。样品为绿猴、骆驼、公狮粪便,但由于绿猴和公狮粪样较少,仅骆驼粪样获得很好的结果。测序获得一株属于β-CoV a亚群的骆驼冠状病毒全基因组序列,全长为28702bp,与牛冠状病毒同源性达91.1%。与猫冠状病毒同源性最低,仅为41.3%。宏基因组测序可用于野生动物粪样中未知冠状病毒的检测以及新冠状病毒的全基因组测序。综述所述,本研究建立了ɑ-CoV、β-CoV的实时荧光定量PCR方法,并应用于两种重要冠状病毒属在多种动物的分子流行病学调查。本研究为动物冠状病毒流行状况监测及跨物种传播预警提供了可靠且有力的技术贮备。