论文部分内容阅读
目的构建重组过表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α并探讨HIF-1α在前列腺癌发生发展过程中的作用及意义。方法(1)根据基因数据库HIF-1α序列,应用primer premier 5.0软件设计针对HIF-1α特异性引物,以前列腺癌细胞PC-3的cDNA为模板,采用RT-PCR扩增功能基因片断;(2)将HIF-1α扩增片断和空质粒pcDNA3.1采用BamH I和Xbar I酶切,连接,构建重组表达质粒;(3)将重组质粒转染入前列腺癌细胞PC-3中,并借助western blot方法检测HIF-1α蛋白在前列腺癌细胞中的表达;(4)将重组过表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α及RNAi干扰质粒pll3.7-siHIF-1α转染入前列腺癌细胞PC-3中,采用G418 400ug/l浓度筛选细胞4周,所得单克隆细胞继续培养,分别命名为pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3细胞株、pcDNA3.1-PC-3细胞株、pll3.7-siHIF-1α-PC-3细胞株、pll3.7-PC-3细胞株、PC-3细胞株,检测不同组中HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白的表达情况,并应用MTT和transwell小室分析HIF-1α在过表达情况下细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组过表达质粒经双酶切后凝胶电泳及序列测定证实,扩增基因片段为HIF-1α基因片段,并且与基因数据库中公布系列完全一致,转染入前列腺癌细胞PC-3后能够过表达,表明HIF-1α重组过表达质粒构建成功;重组过表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α与GFP质粒、RNAi载体pll3.7-siHIF-1α同时转染处于对数生长期前列腺癌细胞PC-3后,评估转染效率分别为(49.24±2.56)%、(42.36±2.62)%,检测结果表明在过表达转染组前列腺细胞PC-3中HIF-1αmRNA表达同其他几组相比增强不明显,但蛋白表达明显增加,而干扰组HIF-1αmRNA与蛋白表达均明显降低,且与其相关的因子除VEGF外表达均显著低于过表达组;MTT及transwell小室检测结果显示在HIF-1α过表达情况下细胞增殖能力明显增强,侵袭细胞数明显增多。结论利用RT-PCR成功构建HIF-1α重组过表达质粒,且在HIF-1α过表达的情况下前列腺癌细胞增殖及侵袭能力明显增强,表明HIF-1α与前列腺的发生发展及侵袭转移存在密切的联系,揭示HIF-1α可能作为前列腺癌发病机理中重要因素,为前列腺癌的发病机制研究提供了一个新的基础,同时提示将HIF-1α作为靶点的基因治疗有望成为一种新的治疗前列腺癌途径。