研究背景和目的HBV感染是世界性卫生难题,据世界卫生组织(WHO)2015年公布数据,目前全球有2.4亿慢性乙型肝炎患者,每年有超过78万人死于由乙型肝炎所致肝硬化和肝癌等并发症。目前HBV的治疗主要依赖于干扰素和核苷酸类似物,不但未能完全清除HBV,且有一定的毒副作用及停药易反跳、潜在耐药性等缺点。而microRNA在感染方面的重要作用为进一步研究HBV感染提供了新的方法。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,成熟的miRNA通过形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),调控转录后的基因表达。miRNA除了参与正常的生理过程外,还在感染、肿瘤发生发展、心脑血管疾病等方面发挥重要的作用,为相关疾病的诊治提供新的突破点。而miR-21和miR-132是近年发现与HBV感染相关的miRNA。miR-21参与肝脏损伤的修复过程,在急性肝衰竭、部分肝切除后miR-21表达升高,促进正常肝细胞再生,但其本质上是一种充当促癌基因作用的miRNA,参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭过程。尤为特殊的是miR-21在与HBV、EB等病毒感染相关的癌症中起促癌作用。miR-21在HBV相关性肝癌(HCC)中表达升高,目前研究发现miR-21可通过抑制促凋亡蛋白PTEN、Fas-L等抑癌基因的表达,发挥促癌基因的作用。miR-21还可与HBx蛋白相互促进,参与HBV的感染过程。c-myc基因则是HBx发挥促癌作用的途径之一。c-myc基因是较早发现的促癌基因之一,其蛋白可与DNA结合,通过多种机制促进肝癌细胞的增殖。因此我们以可试图进一步明确miR-21在慢性HBV感染中对HBV复制、表达的影响,以及其在HBV相关性HCC中对c-myc基因表达的影响。miR-132广泛参与多种细菌、病毒感染和肿瘤致病过程。既往在免疫细胞中的研究发现,miR-132对病毒感染主要起促进作用。miR-132表达升高可抑制巨噬细胞中转录辅激活物p300 (transcriptional coactivator p300)的表达,从而降低干扰素-y (IFN-γ)的表达。但在HBV感染相关肝癌(HCC)中,miR-132的表达被HBx抑制,且miR-132表达降低与HCC的发展相关,提示miR-132在HBV感染中所起的作用可能与其在免疫细胞中不同。在HCC中,有研究证实miR-132能通过Akt/mTOR信号通路(Akt/Mtor signaling pathway)和Yes-associated protein (YAP)抑制癌细胞增殖。而PTEN基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是Akt信号通路上游作用因子之一,其表达降低是HCC发生发展的重要环节。Targetscan数据预测提示PTEN基因是miR-132的作用靶点之一。因此,进一步探讨miR-132在慢性HBV感染中对HBV复制、表达及PTEN基因的表达所起的作用是本研究的另一方面。研究方法1.pmR-21和pmR-132真核重组过表达载体的构建通过miRBase数据库分别查找pre-miR-21(miR-21前体)和pre-miR-132(miR-132前体)序列及其上下游各100bp侧翼序列,用Oligo7软件设计引物。提取HepG2.2.15细胞的DNA作为模板,用PCR扩增前体序列。纯化后的PCR产物经双酶切后分别和pmR-mCherry质粒用T4连接酶于16℃过夜连接。将连接后的产物转化感受态大肠杆菌DH5 α,进行卡那霉素抗性平板筛选。16小时后挑取阳性菌落进行菌落PCR和摇菌扩大培养,提取质粒进行双酶切,以1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组载体正确性。最后选取电泳阳性组的菌株进行测序鉴定。2.重组载体转染HepG2.2.15细胞和HepG2细胞HepG2.2.15细胞培养于含15%FBS的高糖DMEM培养液中(同时添加200 mg/L的G418、10 g/L L-谷氨酰胺以及100000 IU/L青链霉素),HegG2细胞培养于含10%FBS和100000 IU/L青链霉素的高糖DMEM培养液中,置于37℃含5%CO2的培养箱内。取经去内毒素提取的重组载体和pmR-mCherry空质粒按试剂盒操作进行转染,分为pmR-21/pmR-132重组载体组、空载体组、空白组、HepG2阳性对照组。转染24h后在荧光显微镜下观察载体荧光蛋白表达效果。3.流式细胞术检测转染效果转染24h后,用胰酶消化各组细胞,PBS清洗3次,用加样枪轻轻吹匀后上机检测,激发波长为480nm,检测波长为620nm,设空白组为对照孔。4.miR-21和miR-132 qPCR相对定量检测转染24h后,收集各组细胞,提取总RNA,以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。以总RNA为模板,设计针对miR-21、miR-132成熟序列的特异性RT-PCR茎环引物(由广州锐博生物公司设计合成),逆转录后进行qPCR,以U6为内参。采用2-⊿△ct相对定量分析方法检测各组miR-21、miR-132的相对表达量。5.化学发光法检测培养液上清HBsAg和HBeAg取转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液(阳性对照组除外),1500rpm离心5min,吸取上清,用化学发光免疫分析仪进行检测。6.培养液HBV DNA拷贝数检测收集转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液(阳性对照组除外),1500rpm离心5min,按试剂盒操作处理样品,用定量PCR仪检测。每管设2个复孔。7. c-myc基因mRNA水平的RT-PCR检测以总RNA为模板,逆转录成cDNA,以此为模板进行PCR扩增。上游引物为CGTCCTCGGATTCTCTGCTC,下游引物为GCTGGTGCATTTTCGGTTGT。内参为GAPDH,上游引物为：GCTCTCTGCTCCTCCTGT,下游引物为：ATGAGTCCTTCCACGATAC。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后进行灰度值分析。8. PTEN基因mRNA水平的RT-PCR检测以总RNA为模板,逆转录成cDNA,以此为模板进行PCR扩增。PTEN上游引物为：GGGGTGGAACTGTGCACTAA,下游引物为TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG.内参为GAPDH,引物同前述。反应结束后PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳和灰度值分析。9. c-myc/PTEN基因蛋白水平的western blot检测在转染72小时后提取各组细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度并调节各组蛋白样品浓度至相等,变性后进行SDS-PAGE电泳,半干转至PVDF膜,以浓度为1：1500的一抗4℃过夜封闭、1：2000的二抗37℃封闭1小时,TBST洗膜后滴加ECL发光液显影,用灰度值分析条带,计算各组c-myc/PTEN基因的相对表达量。内参为β-actin。10.CCK-8检测细胞增殖取转染24h后各组细胞,胰酶消化后接种到96孔板中,每孔1000个细胞,培养液200ul,每组接种4孔,分别于1至4天检测细胞增殖情况。检测时每孔加CCK-8试剂20ul,培养1.5小时后用酶标仪检测各孔450nm吸光值,绘制生长曲线图。每组设三个复孔,所有实验重复3次。11.统计分析所有数据描述为均数±标准差,用SPSS 20.0软件进行统计学分析,取P＜0.05为有效检验值,两组间采用t检验,多组间采用单因素方差分析。结果1.重组质粒验证菌落PCR产物电泳后可见条带与插入片段大小一致；重组质粒经EcoRI和BamHI双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳可见质粒大片段和插入的基因小片段两条条带,其中pmR-21重组载体小片段位于300bp与500bp之间,pmR-132重组载体小片段位于500bp与750bp之间,分别与pre-miR-21、pre-miR-132的PCR产物大小一致。最终测序证实pre-miR-21、pre-miR-132基因片段已经插入pmR-mCherry质粒中,pmR-21和pmR-132重组载体构建成功。2.转染24小时后荧光显微镜下观察载体荧光蛋白表达效果镜下观察各组细胞形态正常,pmR-21和pmR-132重组载体组、空载体组观察到红色荧光。流式细胞术检测转染效率大于50%。空白组无荧光。3. qPCR检测miR-21相对表达量以空白组为1,转染24h后,pmR-21重组载体组HepG2.2.15细胞中miR-21的相对表达量(18.88±2.35)高于空载体组(1.01±0.11),P<0.01。空载体组和空白组无差异。4. qPCR检测miR-132相对表达量以空白组为1,转染24h后,pmR-132重组载体组HepG2.2.15细胞中miR-21的相对表达量(20.10±2.29)高于空载体组(0.97±0.11),P<0.01。空载体组和空白组无差异。5.转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg检测pmR-21组转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg高于空载组和空白组(P＜0.05),空载组和空白组无统计学差异(P＞0.05)；pmR-132组转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg和HBeAg低于空载组和空白组(P＜0.05),空载组和空白组无统计学差异(P＞0.05)。6.转染后细胞培养液上清HBV DNA拷贝数检测转染24h、48h、72h, pmR-21组细胞培养液上清DNA拷贝数均高于空载组和空白组(P＜0.05),空载组和空白组无统计学差异(P＞0.05)：在转染24、48、72h后,pmR-132重组载体组HBV DNA定量低于空载体组和空白组,P＜0.01。空载组和空白组无差异,P＞0.05。7. c-myc基因的mRNA检测转染24小时后,在内参表达量相当的情况下,空白组和空载体组c-myc mRNA表达量无明显差异,pmR-21重组载体组c-myc mRNA表达量高于空白组和空载组,P<0.05。8. PTEN基因mRNA水平检测以空白组为对照,pmR-132重组载体组在转染24小时后PTEN mRNA表达量高于其余两组(P＜0.05),空载组与空白组无差异。9. c-myc基因的蛋白水平检测western blot显示,与空载体组和空白组对比,pmR-21重组载体组c-myc基因在转染pmR-21重组载体72h表达升高(P＜0.05,与该基因mRNA检测结果一致。10. PTEN基因的蛋白水平检测pmR-132重组载体组PTEN基因在转染pmR-132重组载体72h表达量升高(P＜0.05,空载组与空白组无差异(P＞0.05),与mRNA检测结果一致。11.CCK-8检测细胞增殖转染后,pmR-21重组载体组细胞生长速度快于空载体组和空白组(P＜0.05),空白组和空载组无差异(P＞0.05)；pmR-132组细胞增殖速度慢于空载体组和空白组(P＜0.05),空白组和空载组无差异(P＞0.05)。结论1.miR-21和miR-132真核过表达载体pmR-21和pmR-132构建成功。2.在HepG2.2.15细胞中,miR-21可促进HBV的复制和表达,促进c-myc基因的表达和细胞增殖。3.在HepG2.2.15细胞中,miR-132可抑制HBV的复制和表达,促进PTEN基因的表达并抑制细胞增殖。