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背景衰老是生命体生理功能随时间逐渐退化的过程,也是引起神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等许多慢性疾病的最大风险因素。因此,对衰老的调控机制研究及对衰老的进程干预具有非常重要的实际意义。模式动物秀丽线虫由于其结构简单、生命周期短、操作方便以及遗传调控保守等优势,被广泛应用于寿命调控相关的研究中。在秀丽线虫中,dve-1是哺乳动物satb1/satb2的同源基因,有研究显示satb1/dve-1参与饮食限制和胰岛素/IGF-1信号传导通路对寿命的调节。在以往的研究中,主要利用RNAi的方法对dve-1参与寿命调控的机制进行分析,认为其可能与线粒体UPR有关。但是,根据我们对dve-1(tm4803)突变体的研究发现,其寿命变短与线粒体UPR并没有直接关系。因此,我们直接利用dve-1(tm4803)突变体,从线粒体UPR,经典寿命调控通路胰岛素/IGF-1以及过氧化物酶体功能异常方面,进一步对dve-1调控寿命及衰老的分子机制进行研究。所得结果,为dve-1参与调控寿命的机制提供新的方向。目的本课题主要利用秀丽线虫dve-1(tm4803)突变体为研究对象,揭示dve-1参与寿命调控的分子机制。方法1.分析dve-1(tm4803)突变体的表型:对N2野生型和dve-1(tm4803)突变体的寿命、平均产卵量、生殖周期以及长度进行统计。2.检测dve-1在调控寿命过程中的抗压能力:分别选取N2野生型和dve-1(tm4803)突变体L4之后第一天和第四天的成虫在35℃热激10 h,并选取不同时间点对野生型N2及突变体dve-1(tm4803)的存活数量进行统计比较。3.线粒体UPR与dve-1(tm4803)突变体的寿命变短的关系分析:分别将线粒体UPR的两个转基因分子标记hsp-6p::gfp以及hsp-60p::gfp与dve-1(tm4803)进行杂交,并对其后代分别进行spg-7 RNAi处理。通过荧光结果分析,进而揭示线粒体UPR与dve-1(tm4803)之间的关系。4.揭示dve-1与Insulin/IGF-1经典调控通路主要基因的遗传学关系:分别选取daf-2(e13 70),daf-18(ok480),daf-16(mu86)与dve-1(tm4803)分别构建双突变体进行遗传学分析。并与其各自的单突变体以及N2野生型、dve-1(tm4803)突变体进行比较,分析dve-1调控寿命的机制与这些基因的遗传学关系。5.分析dve-1与重要转录因子DAF-16的调控关系:分别选取daf-16::gfp和dve-1(tm4803);daf-16::gfp第一天和第四天的虫株,分成两组同时进行20℃室温培养和35℃热激实验。观察其在室温和热激之后的DAF-16::GFP的荧光定位,统计DAF-16::GFP在正常情况和热激情况下在N2野生型与dve-1(tm4803)突变体中的入核比率。6.鉴定dve-1与daf-2在dauer形成中的调控关系:将daf-2(e1370),dve-1(tm4803),daf-2(e13 70);dve-1(tm4803)不同突变体的卵在不同温度下(15℃,20℃,25℃)进行培养48h,计算其进入dauer的比率。同时,选取20℃下,将daf-16对上述三个突变体进行RNAi处理,观察dve-1与daf-2在dauer形成中的调控关系是否依赖daf-16。7.检测过氧化物酶体功能在dve-1介导的寿命调控中的作用:利用带有GFP::PTS1的过氧化物酶体的分子标记物杂交到dve-1(tm4803)突变体中。分别在L4之后的第一天,第四天和第七天观察荧光量的变化,统计荧光表达量并比较其差异。结果1.寿命及产卵量结果实验显示:dve-1(tm4803)突变体的平均寿命短于N2野生型的平均寿命;dve-1(tm4803)的平均产卵量低于N2野生型。长度测量结果显示:dve-1(tm4803)的长度略长与N2。2.35℃热激10 h结果显示:dve-1(tm4803)突变体存活数量在第一天和第四天都低于N2野生型,在第四天更加显著。3.spg-7RNAi结果显示:处理后对照组荧光强度明显增强,而dve-1(tm4803)组的荧光强度与对照组很接近。4.遗传学分析结果显示:dve-1(tm4803)与位于胰岛素/IGFP-1三个不同基因的突变体构成的双突变体的寿命以及产卵量,均未与三个突变体当中任何一个突变体的表型一致。说明dve-1调控寿命的途径平行于ⅡS信号通路。5.热激实验结果显示:daf-16::gfp和dve-1(tm4803);daf-16::gfp在20℃下DAF-16::GFP均不入核,而在35℃热激之后,DAF-16::GFP均入核,其结果无明显差异。6.dauer热激实验结果显示:daf-2(e1370),daf-2(e1370);dve-1(tm4803),15℃均未进入dauer,25℃全部进入dauer状态。20℃daf-2(e1370)形成dauer的比例明显大于daf-2(e13 70);dve-1(tm4803)。dve-1(tm4803)突变体作为对照组,三种温度下均未进入dauer状态。daf-16 RNAi处理后也无明显差异,20℃下均未进入dauer状态。7.荧光统计结果显示:GFP::PTS1在突变体tm4803中的荧光量在Day 1,Day4,Day 7均明显高于野生型,尤其在第四天差异最明显。结论1.dve-1(tm4803)突变体寿命变短,且在热激后同一时间点其生存率也明显低于野生型。2.dve-1参与寿命的调控可能与线粒体UPR无关。3.dve-1调控寿命的方式可能与InsuIin/IGF-1经典调控通路平行,且与野生型相比,对于DAF-16::GFP的表达无论热激前后均无明显影响。4.在20℃时,dve-1缺失后降低了daf-2(e1370)dauer形成的比率。5.dve-1(tm4803)突变体的寿命减少可能与过氧化物酶体功能异常有关。