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本文应用激光共聚焦显微镜成像技术和膜片钳对失血性休克后大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞（arterial smooth muscle cell，ASMC）大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium activated potassium channel，BKCa)的变化及其机制进行了研究，结果如下：1．同步记录正常大鼠BKCa的一过性外向性电流（STOC）和ASMC的钙火花的变化钙火花为细胞内肌浆网上一个或数个Ryanodine受体（RyR）所介导的钙释放的基本单位。在血管平滑肌细胞上，钙火花能够激活细胞膜上的数个或数十个BKCa通道，形成自发性外向性电流（STOC），从而引起细胞膜超极化，介导血管平滑肌的舒张。本实验用共聚焦显微镜和膜片钳技术分别观察正常大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞内自发性发放的钙火花的频率、持续时间和空间分布，发现：ASMC中的钙火花多分布于靠近细胞膜的部位；可以同步记录到钙火花和STOC同时发放，并且阻断BKCa通道后钙火花的发放不受影响，可以有力的证明钙火花能够激活BKCa通道，引起自发一过性外向电流（STOC）。咖啡因10mmol／L能够使STOC的开放频率增加，且呈规律性的簇状（cluster）开放，说明STOC的活动与肌浆网Ryanodine受体和细胞膜上的BKCa通道的活动有关；将浴槽液换成无Ca2+的HPSS液，同时用EGTA 5mmol／L鳌合所有细胞外钙，则记录不到STOC，说明STOC的激活与细胞外钙密切相关。在钳制电压为0mV时，钙火花的平均时间半高宽（full duration half maximum，FDHM）为45.64±2.91 ms，平均空间半高宽（full width half maximum，FWHM）为1.75±0.05μm，平均荧光值1.27±0.01。STOC的平均振幅17.96±0.25 pA，平均上升时间6.05±0.25 ms。在钳制电压为-40mV时，钙火花的平均时间半高宽（FDHM）为62.64±6.24ms，平均空间半高宽（FWHM）为1.79±0.10μm，平均荧光值1.3301±0.02。STOC的平均振幅7.26±0.39 pA，平均上升时间6.25±1.17 ms。2．同步记录失血性休克大鼠BKCa的一过性外向性电流（STOC）和ASMC的钙火花的变化失血性休克2小时后，在钳制电压为0mV时，休克组大鼠比正常组大鼠STOC的平均振幅高，平均持续时间长，其钙火花的平均荧光值、平均时间半高宽、平均空间半高宽也均较正常组高，分别为：休克组STOC的平均振幅21.49±1.12 pA，平均上升时间8.19±0.20 ms，钙火花的平均时间半高宽为58.19±3.56 ms，平均空间半高宽为2.02±0.05μm，平均荧光值1.37±0.01，与正常组比较均有显著性差异（P＜0.05，独立样本t检验）。在钳制电压为-40mV时，休克组STOC的平均振幅9.99±0.59 ms，平均上升时间7.33±1.30 ms，钙火花的平均时间半高宽为52.25±6.62 ms，平均空间半高宽为1.97±0.13μm，平均荧光值1.37±0.04，其中STOC的平均振幅和钙火花的平均荧光值与正常组比较均有显著性差异（P＜0.05，独立样本t检验）。另外，我们将0mV和-40mV时，正常组和休克组的钙火花荧光值与STOC电流幅度的比值进行比较，发现休克组的钙火花荧光值与STOC电流幅度的比值比正常组的显著增高（P＜0.05）。这也就证明，失血性休克后，钙火花与STOC的偶联程度增加。根据我们所记录的结果，失血性休克后一过性外向型电流（STOC）的电流幅度和钙火花的荧光值都有明显增高，并且钙火花与STOC的偶联程度增加。这也就与钙火花激活BKCa通道，导致平滑肌细胞膜超极化、平滑肌舒张的结论一致。3．血管平滑肌BKCa的α亚基和β1亚基表达的变化目前认为BKCa广泛分布于除心肌以外的各种组织，在平滑肌上尤其丰富。BKCa通道由形成孔道的α亚基和辅助的β1亚基组成，它们共同影响和决定着BKCa通道的生理学和药理学特性。BKCa的α和β1亚基连接很紧密，它们之间的空隙不到12（?）。虽然BKCa通道α、β1亚基结合的结构多见，但也有的BKCa通道只有α亚基，而无β1亚基。BKCa通道有各种各样的亚型，都具有不同的钙敏感性，BKCa通道的钙敏感性由β1亚基决定。最近发现，高血压大鼠BKCa通道的α和β1亚基的表达发生了变化：有报道高血压时血管平滑肌上BKCa通道的α亚基上调，也有报道血管平滑肌上BKCa通道β1亚基下调。并且将小鼠BKCa通道的β1亚基被敲除后，发现钙火花不能激活BKCa通道，而血管平滑肌细胞膜发生去极化，血管收缩，血压升高。这表明高血压时，BKCa的β1亚基的下调可能起了主要作用，阻断了钙火花激活BKCa通道的路径，影响了细胞膜的超极化，导致血管舒张-收缩平衡被打乱。在本实验中，通过免疫荧光标记α和β1亚基，发现失血性休克2小时后，BKCa通道β1亚基荧光值显著增加，由此我们推测BKCa通道β1亚基表达增加，并且参与调节BKCa通道的激活，细胞膜超极化，血管舒张。数据结果统计及其差异显著性检验用SPSS11.0独立样本t检验（两组）、非参数检验采用两独立样本秩和检验进行。统计结果用均数±标准误（Mean±SE）表示，作图用Origin7.0进行。P＜0.05认为差异有显著性意义。结论：1．失血性休克2小时，BKCa活动增强，ASMC细胞膜超极化；2．同步记录到钙火花和STOC同时发放，并且阻断BKCa通道后钙火花的发放不受影响，可以有力的证明钙火花激活BKCa通道，引起自发一过性外向电流STOC。3．根据BKCa、钙火花和STOC电流的研究，提出了休克时非收缩区钙变化影响了收缩区钙含量，从而带来血管反应性下降的假说：休克时肌浆网释放钙增多，激活BKCa引起STOC电流增加，带来细胞膜超极化和VOC抑制，致使交感神经兴奋和NE作用时外钙内流减少，引起收缩区钙增加量不足，使细胞处于低反应状态。4．失血性休克2小时，BKCa通道β1亚基表达增加，可能参与调节BKCa的激活。