目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见并发症,是引起终末期肾衰的主要原因之一,其主要病理变化为肾小球肥大,肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质聚集、肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化等。以往对DN的研究大多集中在肾小球病变,而对肾小管间质病变的发生发展及其机制研究较少。近来越来越多的研究表明糖尿病肾小管间质病变的严重程度与肾功能的进行性下降密切相关。高糖可诱导肾小管上皮细胞表型向间充质细胞转变,分泌并聚集细胞外基质而导致肾间质纤维化发生。糖尿病肾病小管间质病变是决定其肾功能下降水平及预后的重要因素。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号途径参与细胞增殖、分化、存活、凋亡及细胞迁移等多种功能的调控,在胚胎发育、肿瘤发生和器官纤维化等重要生理及病理过程中发挥重要作用。已有研究表明Wnt/β-catenin信号途径调节高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡过程,在单侧输尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)肾脏该途径表达上调,提示此途径可能参与了慢性肾脏病的发病。整合素连接激酶(Integrin-linkedkinase,ILK)被认为是转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)下游最重要的致纤维化因子之一。在慢性肾脏病、糖尿病肾病及UUO模型梗阻侧肾脏均发现ILK过度表达加重细胞外基质的积聚及肾脏纤维化的程度。ILK过度表达可激活Wnt信号通路下游分子,也就是说通过抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)活性促使β-catenin核聚集。ILK可能通过与Wnt信号途径“串话(cross talk)”而参与了肾小管间质纤维化的发病。在糖尿病肾脏病变中Wnt/β-catenin信号转导途径的作用及该途径与ILK的关系尚有许多未知。本研究应用糖尿病大鼠模型和体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HKC),系统观察了Wnt/β-catenin信号途径及ILK在早期糖尿病肾病以及高糖诱导HKC转分化中的表达;用ILK小干扰RNA(ILKsiRNA)沉默ILK基因表达,观察了Wnt/β-catenin途径下游因子在高糖诱导HKC转分化过程中的变化;并结合糖尿病肾病患者肾脏Wnt/β-catenin信号途径表达的变化,以进一步探讨Wnt途径在糖尿病肾病肾小管间质纤维化中的作用。以期为进一步阐明糖尿病肾小管间质纤维化发病机制及寻找新的治疗靶点提供依据。方法:1大鼠糖尿病模型的制备和ILK、Wnt4、GSK -3β、β-catenin蛋白及mRNA的检测Wistar雄性大鼠均行右肾切除术,伤口愈合后随机分为对照组(CG)和糖尿病组(DM),DM组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素65mg/kg(STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5),对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,48h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++~++++者确定为DM模型。成模后4、8、12周每组取6只大鼠,切取肾脏。取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛固定,用光镜及免疫组织化学染色法检测,免疫组化检测指标包括ILK、Wnt4、β-catenin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;取部分肾皮质组织提取总蛋白及核蛋白,Western blot检测ILK、Wnt4、β-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β蛋白(P-GSK-3β)表达;取部分肾皮质组织提取总RNA,半定量RT-PCR检测Wnt4、β-catenin mRNA表达。2细胞培养和ILK、Wnt4、GSK -3β、β-catenin蛋白及mRNA的检测体外培养HKC,无血清DMEM培养基同步培养24h,细胞分成3组:正常糖组(NG,D-Glucose 5.5mmol/L ),甘露醇对照组(NG+M, D-Glucose 5.5 mmol/L+mannitol 24.5 mmol/L) ,高糖组(HG,D-Glucose 30 mmol/L ),培养12、24、48、72h后收集细胞提取细胞总蛋白、核蛋白及RNA。采用免疫细胞化学检测Wnt4、β-catenin及E-钙粘蛋白(E-cadherin),α-SMA的表达;Western blot检测ILK、Wnt4、GSK-3β、P-GSK-3β、β-catenin蛋白的表达;半定量RT-PCR检测细胞Wnt4、GSK-3β及β-catenin mRNA的水平。3 HKC ILKsiRNA转染及ILK、GSK -3β、β-catenin表达的检测针对HKC ILK编码序列分别设计3条体外转录的shRNA。应用lipofectamine 2000转染试剂将Pgenesil-1.1- ILKsiRNA真核表达载体转染入HKC,分成6组:①正常对照组(NG)②高糖组(HG)③高糖+阴性转染对照组:转染pGenesil-1.1-HK(HG+HK)④高糖+pGenesil-1.1-ILK-1(HG+ILK-1siRNA)组⑤高糖+ pGenesil-1.1-ILK-2 (HG+ILK-2siRNA)组⑥高糖+pGenesil-1.1-ILK-3 (HG+ILK-3siRNA)组。转染48h荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。Western-blot及RT-PCR检测ILK蛋白及RNA表达水平,确定敲低效果最佳的ILK siRNA。免疫细胞化学法检测P-GSK -3β、β-catenin表达。Western blot检测GSK-3β、P-GSK -3β、β-catenin、E-cadherin和α-SMA表达。4病例选择及肾组织Wnt4、P-GSK -3β、β-catenin的表达的检测选择2006.10-2008.10在河北医大二院肾内科住院、经临床与肾活检诊断为糖尿病肾病患者33例(其中男性18例,女性15例,年龄28–70岁,48.7±10.3岁)。除外狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎、甲状腺病相关性肾损害、类风湿性关节炎肾损害以及肿瘤相关性肾病等继发性肾脏病患者,并除外合并急性肾小管坏死和急、慢性间质性肾炎的患者。糖尿病肾病患者根据肾小管间质病变程度分为两组,轻中度组20例,重度组13例。10例肾肿瘤患者远离肿瘤的正常肾组织作为对照。详细收集患者临床资料,包括年龄、病程、血浆白蛋白、24小时尿蛋白定量、血肌酐等。免疫组化法检测Wnt4、P-GSK -3β、β-catenin蛋白的表达。结果:1糖尿病大鼠肾组织ILK、Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白和mRNA的表达①免疫组化显示ILK ,Wnt4在对照组部分肾小管上皮细胞弱表达,α-SMA仅见于血管平滑肌细胞。糖尿病组表达增强(P <0.05或P <0.01)。β-catenin在对照组表达于肾小管上皮细胞基底侧,糖尿病组胞浆表达增强,部分胞核表达。(P <0.05或P <0.01)。②Western blot结果显示ILK、Wnt4、P-GSK-3β及核β-catenin在糖尿病组表达较对照组均增强,并随时间延长更加明显(P<0.05);β-catenin总蛋白及GSK-3β在各组及各时间点无明显变化(P> 0. 05)。③半定量RT-PCR结果显示,Wnt4 mRNA在对照组有少量基础表达,糖尿病组表达增高(P<0. 05)。β-catenin mRNA在各组表达无明显差异(P> 0. 05)。2高糖培养下HKC ILK、Wnt4、GSK -3β、β-catenin蛋白和mRNA的表达①免疫细胞化学显示,Wnt4在正常糖及甘露醇对照组HKC胞浆有少量表达,高糖组表达明显增强;对照组β-catenin主要在HKC胞膜,胞浆有少量表达,高糖组β-catenin胞浆及胞核表达明显增强(P<0.01);E-cadherin在对照组肾小管上皮细胞表达明显,而高糖组表达减弱;α-SMA表达与E-cadherin相反(P<0.05)。②Western blot显示高糖组HKC Wnt4、p-GSK-3β、核β-catenin、ILK表达明显增强(P<0.05),Wnt4、p-GSK-3β、核β-catenin在高糖刺激24 h达高峰(P<0.05或P<0.01),ILK表达在高糖刺激48 h达高峰(P<0.05);总β-catenin、GSK-3β在各组之间及各时间点表达无明显差异(P>0.05)。③RT-PCR结果显示高糖组肾小管上皮细胞Wnt4 mRNA表达明显上调(P<0.05);GSK-3β及β-catenin mRNA在各组表达量基本一致,无统计学意义(P>0.05)。3 ILKsiRNA瞬时转染HKC后ILK、β-catenin、GSK -3β的表达①转染HKC细胞后绿色荧光蛋白表达:pGenesil-1.1-ILK-1siRNA、pGenesil-1.1-ILK-2siRNA、pGenesil-1.1-ILK-3 siRNA转染HKC细胞48小时后,荧光倒置显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,证实质粒成功转染HKC细胞并能够表达绿色荧光蛋白②转染HKC细胞后ILK RNA及蛋白表达:与HG和阴性对照质粒组(HG+HK)相比,pGenesil-1.1-ILK-1 siRNA、pGenesil-1.1-ILK-2 siRNA、pGenesil-1.1-ILK-3 siRNA质粒转染组可见ILKmRNA水平下降,抑制率分别为36.47%、25.11%及43.15%;ILK蛋白表达下降,分别比HG及HG+HK减少41.59%,29.78%和56.12%,但较NG组表达仍高(p<0.05)。③免疫细胞化学显示:pGenesil-1.1-ILK-3转染HKC细胞48h后胞浆P-GSK-3β、胞浆及核β-catenin比HG及HG+HK组表达下降,但较NG组表达仍高(p<0.05)。④Western blot显示:pGenesil-1.1-ILK-3转染HKC细胞后P-GSK-3β、β-catenin核蛋白均较HG及HG+HK组表达下降(P<0.05);GSK-3β与总β-catenin在各组表达无明显差异( P>0.05);E-cadherin在HG+ILK-3siRNA的表达较HG及HG+HK组有所升高,α-SMA表达与E-cadherin相反(P<0.05或P<0.01)。4糖尿病肾病患者肾组织病理变化及Wnt4、P-GSK -3β、β-catenin的表达①肾组织的病理改变:轻中度组DN患者肾病理主要表现为肾小球的肥大,系膜细胞增生,系膜区增宽,肾小球及肾小管基底膜轻度增厚,局灶性肾小管上皮细胞颗粒变性、萎缩及间质纤维化。重度组DN患者肾组织出现典型的K-W结节,甚至球性硬化,弥漫性肾小管间质纤维化。②免疫组化结果:对照组Wnt4、p-GSK-3β仅微弱表达于部分肾小管上皮细胞,糖尿病肾病轻中度组表达增强,在重度组表达下降(P<0.05);β-catenin在对照组少量表达于肾小管上皮细胞基底膜侧,糖尿病肾病轻中度组肾小管上皮细胞及肾间质细胞胞浆表达明显增强,部分细胞胞核呈阳性表达。而在重度组表达减弱,尤其在重度纤维化病变处几乎不表达(P<0.05)。③Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin表达均与24小时尿蛋白定量成正相关,而与估算的肾小球滤过率(eGFR)成负相关(P<0.05)。结论:1 Wnt/β-catenin信号途径在糖尿病肾病早期以及高糖诱导肾小管上皮细胞转分化过程中表达增高,该途径可能参与了糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发生和进展。2 ILK在糖尿病肾病早期肾小管间质病变及高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化过程中表达增高;转染HKC ILKsiRNA能成功沉默ILK基因,使P-GSK-3β及核β-catenin表达下调,并使高糖诱导下调的E-cadherin水平升高,α-SMA水平降低而阻止肾小管细胞转分化,提示ILK可能通过调节Wnt/β-catenin途径下游因子活性参与肾小管细胞转分化过程。3 Wnt/β-catenin信号途径在糖尿病肾病患者肾小管间质表达增高,但在重度肾小管间质纤维化病变表达下调,其变化可能参与了人类糖尿病肾病肾间质纤维化的发病与进展。