研究背景脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)是近40种眼病的共有体征,视网膜下病理性新生血管的生长不但损伤正常脉络膜视网膜结构,而且常发生出血渗漏,往往造成严重视力损害。CNV的发生机制复杂,涉及多种细胞、因子和信号通路,确切机制尚未完全阐明。成年个体新生血管的形成包含两种机制:血管生成(angiogenesis)指原有的血管细胞发生增生、移行,形成新的血管;血管发生(vasculogenesis)指由干细胞分化而来的血管细胞构成新血管。干细胞在一般情况下处于“休眠”状态,在外因刺激或病理状态下会进入血液循环,移行至周边组织,表现出不同程度的更新和分化能力,参与组织修复和新生物形成。近期的研究表明,CNV的生成兼具这两种方式,既有原位组织细胞的增殖,又有骨髓来源细胞(bone marrow-derived cells, BMCs)的参与,但BMCs究竟以何种方式参与CNV生成、BMCs对CNV发展有何影响有待进一步阐明。此外,BMCs是一个异质性细胞群体,包含多种干/祖细胞,究竟是哪种干/祖细胞参与了CNV的生成、它们在CNV发生发展中发挥着怎样的作用、是否可作为CNV治疗的靶点等诸多问题有待研究。目的和内容探讨BMCs在CNV发生发展中的作用,在危险因素影响CNV发展中的介导作用,及作为干细胞疗法细胞载体的潜能。⑴建立C57-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)嵌合体小鼠,观察在嵌合体CNV发生发展过程中,BMCs在CNV聚集、分化和表达蛋白情况;⑵探讨尼古丁对参与CNV生成的BMCs的趋化、分化和蛋白表达能力的影响;⑶观察骨髓来源基质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向CNV的趋化特异性和时间窗,观察MSCs参与CNV生成情况,探讨MSCs是否具备作为药物载体的潜能;⑷构建表达人源性色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)的腺病毒,观察腺病毒转导的MSCs对CNV的抑制作用,探讨利用MSCs靶向治疗CNV的新策略。方法⑴通过GFP转基因小鼠与野生型C57小鼠的骨髓移植建立嵌合体小鼠,利用532nm激光建立小鼠CNV模型,脉络膜铺片观察GFP-BMCs向CNV趋化、参与血管结构组成的情况,免疫荧光染色观察CNV中BMCs分化的细胞类型(包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞)及表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor, bFGF)的情况;⑵激光光凝建立C57-GFP嵌合体小鼠CNV模型后,即日在其饮水中添加尼古丁(100μg/ml),对照组嵌合体小鼠建立CNV模型后普通饲养,4周后眼球切片HE染色观察CNV厚度与直径,脉络膜铺片观察CNV表面积、GFP-BMCs的趋化和参与构成血管情况,免疫荧光染色观察CNV中BMCs分化情况及各因子表达变化;⑶体外培养GFP转基因小鼠骨髓来源MSCs,野生型小鼠激光建模后0.5-1小时尾静脉注射4.0×106 GFP-BMCs或GFP-MSCs,激光后1、3、7天,心、肝、脾、肺、心脏切片荧光观察比较两种细胞在器官内的滞留情况;野生型小鼠激光后0.5-1小时、3天及6天,分别注射4.0×106 GFP-MSCs,激光后7天观察比较单次注射、双次注射和三次注射后GFP-MSCs在体内移行和向CNV趋化的情况;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫荧光染色检测激光后不同时间眼内干细胞趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)的表达;脉络膜铺片检测参与构成新血管的GFP-MSCs,免疫荧光染色分析CNV中GFP-MSCs分化的细胞类型;⑷构建表达人源性PEDF、含报告基因GFP、E1 E3缺陷的5型腺病毒(adenovirus, Ad),转导体外培养的野生型小鼠骨髓来源MSCs,倒置荧光显微镜观察及流式细胞仪测定感染效率,ELISA检测体外人源性PEDF表达情况;激光后0.5-1小时小鼠尾静脉分别注射4.0×106 Ad-PEDF/MSCs、对照病毒Ad-GFP/MSCs、GFP-MSCs及0.4ml磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS),分别于激光后1、3、5、7天利用免疫荧光染色和ELISA检测眼内人源性PEDF表达,激光后7天眼球切片组织学分析和脉络膜铺片分析比较各组CNV厚度、直径及表面积。体外建立视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞与MSCs的共培养体系,分析MSCs分泌的PEDF对RPE细胞增生和移行的影响。结果⑴激光后大量GFP-BMCs聚集于激光斑处并整合入CNV中的血管结构内,由其组成的血管面积约占CNV表面积的16.22%。GFP-BMCs主要分布于CNV区域(包括CNV深层的脉络膜),少量散布于CNV表层的视网膜、角巩膜缘、睫状体、视盘周围及远离CNV的视网膜、脉络膜和巩膜。CD31或αSMA阳性的GFP+细胞仅出现于CNV区域,F4/80+/GFP+细胞不仅出现在CNV区域,还出现在CNV表层的视网膜、角巩膜缘和睫状体内。CNV内CD31/GFP、αSMA/GFP和F4/80/GFP双阳性细胞在全部GFP+细胞中的构成比随CNV进展而变化,CD31/GFP或F4/80/GFP双阳性细胞构成比的最高值出现于激光后第2周,而αSMA+/GFP+细胞构成比在激光后4周仍处上升趋势。CNV区域的一些GFP-BMCs可表达促血管形成因子VEGF和bFGF。⑵尼古丁处理组小鼠CNV长度和表面积增大,CNV内GFP-BMCs的面积和密度增加,GFP-BMCs来源的血管细胞面积增加,F4/80+/GFP+细胞构成比下降,CNV内VEGF和bFGF的表达及CNV下脉络膜内VCAM-1的表达上调。⑶在整个观察期间,肺、肝和脾内可见GFP+BMCs滞留,但未观测到GFP+MSCs。单次、双次或三次MSCs注射后趋化至CNV的MSCs的数量没有明显差异,双次和三次注射组小鼠的脾内发现大量GFP-MSCs。SDF-1免疫荧光染色显示,激光后初期,SDF-1在激光斑处RPE层表达,随着CNV生成,CNV内出现阳性染色;ELISA结果显示,SDF-1表达水平在最初24小时内迅速增加,在第2天时达顶峰,然后迅速下降。MSCs移植后外周血和骨髓的流式分析显示,MSCs仅于第1天内在骨髓中作短暂停留。脉络膜铺片显示,激光后第1天,GFP-MSCs散布于激光斑周围;第3天时,GFP-MSCs组成的“细胞环”围绕激光斑,显示出向CNV靠近的定向移行趋势;第7天,GFP-MSCs进入CNV内并加入血管组成中。眼球切片显示绝大多数GFP-MSCs位于激光斑处脉络膜与光感受器间的CNV内。在这些MSCs中发现了血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、上皮细胞和成纤维细胞的标记物(CD31,αSMA, F4/80, keratin,和vimentin)的阳性表达。⑷Ad转导小鼠MSCs后24小时,倒置荧光显微镜检测到报告基因GFP的表达,流式分析显示(73.6±5.3)%的细胞转导成功,AdPEDF转导的MSCs在体外表达PEDF可持续至少8天。AdPEDF组小鼠的眼球切片中,人PEDF的阳性染色出现于MSCs内及其周围的细胞外基质中;ELISA结果显示,在整个观察期间,眼内人PEDF呈稳定表达,表达量是抑制CNV阈值的4倍多;其CNV的厚度、长度和表面积明显减小。与AdPEDF/MSCs共培养的RPE细胞较之其他共培养条件下的RPE细胞增生和移行更快。结论⑴BMCs分化为多种细胞类型参与CNV细胞构成,分泌促血管形成因子促进CNV发展,在CNV生成过程中发挥着重要作用。CNV微环境趋化BMCs,并支持和调控BMCs的分化方向。BMCs与CNV微环境可能存在相互作用。⑵尼古丁促进BMCs向CNV趋化和参与CNV生成,并影响CNV内BMCs的分化。尼古丁对BMCs的这种作用可能部分通过调节局部因子(如VEGF、VCAM-1)表达实现。⑶MSCs仅出现于CNV而不在其他器官停留(骨髓中一过性停留),提示其在CNV模型中具有比BMCs更为卓越的特异趋化能力;一次激光光凝引起的MSCs趋化具有有限的时间窗,其原因可能是激光后CNV区域趋化因子的表达规律。激光后MSCs逐步趋化至CNV内,并分化为CNV生成所需的多种细胞类型。MSCs具备作为细胞载体的潜能。⑷经基因修饰的MSCs到达CNV部位并在局部表达抗新生血管形成因子,从而抑制了CNV的生长,该效应可能部分通过在CNV发展中发挥重要作用的RPE细胞介导。MSCs有望作为抗新生血管药物的释放系统用于CNV相关疾病的治疗。