[研究背景]阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知障碍并影响日常生活能力为主要临床表现的神经系统变性疾病。其主要病理特征为老年斑、神经元纤维缠结和继发的炎症反应。AD的发病机制错综复杂,尚不完全清楚。神经小胶质细胞的活化引起脑内慢性炎症反应已被证明在AD的发病机制中发挥关键作用。糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)是还原糖与蛋白质的氨基经过复杂的非酶促反应形成的不可逆聚合物。AGEs被发现在AD的神经元纤维缠结和老年斑大量聚集,参与AD的发生及发展。现已证明AGEs能促进对老年斑进行修饰,激活邻近的小胶质细胞导致氧化应激和产生炎性因子,从而导致AD早期的炎症反应,但AGEs如何激活小胶质细胞引起炎性反应机制不清。因此,本研究的一个主要目的是拟在体外水平上探讨AGEs诱导小胶质细胞活化及氧化应激的发生机制。AGEs可通过糖基化作用直接破坏机体内许多蛋白质的正常结构,还可通过与特异受体(Recepter for advanced glycation end products,RAGE)结合,引起下游多条信号通路的改变,产生一系列的生物学效应。RAGE属于细胞表面分子中免疫球蛋白超家族的多配体成员,其配体有Aβ、AGEs、S100、HMGH1。现已知A β与RAGE结合激活神经细胞胞内ERK1/2、JNK及P38等多条信号通路,参与AD发生发展。我们前期研究发现AGEs作用其受体导致内质网应激,还能促进Aβ生成和tau蛋白异常磷酸化。降低RAGE的表达或者竞争性阻断RAGE与配体的结合能够明显改善AGEs-RAGE导致的一些列病理变化。因此,阻断RAGE很可能成为防治AD的新靶点。目前阻断RAGE的措施主要包括RAGE抗体及sRAGE及RAGE基因敲除,前二者均不能通过血脑屏障,对AD的治疗作用受到限制。发展小分子RAGE阻断剂成为新的发展趋势。2012年Deane首次发现一种新型小分子RAGE阻断剂FPS-ZM1,该药能抑制AD鼠脑内A β生成和炎症反应,明显改善认知功能,而且低毒性,能够透过血脑屏障,有望成为一种有前景的RAGE阻断剂。但FPS-ZM1的神经保护作用机制需要深入研究,本研究的另一个主要目的是拟在体外水平上探讨FPS-ZM1对AGEs诱导小胶质细胞活化及氧化应激的保护作用及可能机制。[目的]1.体外水平研究糖基化终末产物对原代培养的小胶质细胞活化及氧化应激及细胞因子的影响及可能机制。2.评价新型小分子RAGE阻断剂FPS-ZM1对糖基化终产物诱导小胶质细胞激活引起的氧化应激及炎症反应的保护作用及可能机制。[研究方法]1.小胶质细胞的混合培养及小胶质细胞的分离纯化取出生3d内的Wistar大鼠8只,在无菌环境下断头取脑,制备成单细胞悬液进行混合细胞培养。再将小胶质细胞从混合培养的细胞中分离,纯化。2.用MTT法观察细胞形态变化以及AGEs-BSA对原代小胶质细胞损伤模型的建立以培养的小胶质细胞为模型,分别加入(0、50、100、200、300、400 μg/mL)蛋白浓度的BSA和AGEs-BSA。用MTT法测各自的细胞存活率,确定AGEs-BSA最佳作用浓度和作用时间。经研究表明300 μg/mL AGEs-BSA作用24h可以导致小小胶质细胞活力下降至正常对照组的50%左右,不同浓度的BSA对小胶质细胞活力没有明显影响。3.免疫细胞化学方法进行小胶质细胞鉴定以CD11b为小胶质细胞特异抗原标记,采用免疫细胞化学标记CD11b阳性鉴定小胶质细胞并观察其形态,细胞呈棕色者为阳性细胞。4.分组及干预将原代小胶质细胞进行分组,将纯化后的小胶质细胞接种于6孔培养板(4×105个/mL,1mL/孔)中,AGEs干预后分组:①BSA对照组(Control组,在培养液中加入 BSA,培养 24 hours);②AGEs-BSA 组(AGEs 组,AGEs-BSA 300 μg/mL,培养 24 hours);③AGEs+F1 组(25nM FPS-ZM1 干预 1hour,再加 300 μ g/mL AGEs-BSA,24 hours),④AGEs+F2 组(50 nM FPS-ZM1 干预 1hour,再加 300μg/mL AGEs-BSA,24hours),⑤AGEs+F3 组(100nM FPS-ZM1 干预 1hour,再加 300μg/mLAGEs-BSA,24hours),收集细胞上清液,-80℃保存,以备测定TNF-α、IL-1β、COX-2 及 NO 的浓度。5.细胞氧化损伤及抗氧化指标检测活性氧(ROS)荧光定量(DCFH-DA)法检测采用硫代巴比妥酸法应用MDA检测试剂盒测定细胞内MDA的含量;采用二硫代二硝基甲酸比色法应用GSH测定试剂盒检测细胞内GSH含量,采用黄嘌呤氧化酶法用SOD测试盒检测细胞内SOD的含量。同时应用考马斯亮蓝法测定小胶质细胞内蛋白浓度以校正细胞内各指标的含量。6.ELISA 检测应用ELISA检测试剂盒测定细胞上清液的IL-1 β、TNF-α、磷酸化NF-κ Bp65及COX-2、N0的水平,具体按说明书步骤操作。7.Western blot 检测Western blot检测iNOS表达、NADPH氧化酶相关亚基NOX2、p47phox和p67phox及Nrf2-HO-1抗氧化通路相关指标Nrf2、HO-1的蛋白表达。8、为进一步明确NOX和iNOS、Nrf2、ROS在AGEs介导的小胶质细胞氧化损伤及炎症反应中的作用,设计Control组及AGEs组方法同上所述,干预组分别加入NOX抑制剂API、iNOS抑制剂SMT、ROS抑制剂NAC和Nrf2激动剂SFP干预 1hour,300μg/mLAGEs-BSA,24hours,分别测定 ROS、NO 生成、SOD、HO-1及NF-κBp65的表达,方法同上。[统计学处理]所有数据应用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料采用随机区组设计单因素方差分析,数值采用均数±标准差(X±S)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1..AGEs-BSA对原代小胶质细胞增殖活力的影响小胶质细胞为模型,分别加入(0、50、100、200、300、400 μ g/mL)蛋白浓度AGEs-BSA分别作用24、48和72h。小胶质细胞随着AGEs-BSA浓度的增加,还原率逐渐降低。小胶质细胞24h、48h后,200 μ g/mL AGEs-BSA以上组细胞活力显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);300 μ g/mL AGEs-BSA作用48和72h后,细胞活力显著下降达到50%,差异有统计学意义(P<0.01)。见图22.FPS-ZM1对AGEs-BSA小胶质细胞的活化作用的影响结果显示,control组多为静止期小胶质细胞,此期细胞体积较小,形态呈小圆型,少量细胞伸出细长弯曲的突起呈分枝状。AGEs组及不同浓度FPS-ZM1干预组大部分细胞活化,发现多数细胞呈阿米巴样,有的胞体变得肥大,胞核大而圆;有的胞体变为梭形,胞浆内颗粒物增多,以AGEs组最为明显,各FPS-ZM1干预组小胶质细胞活化程度较AGEs组明显减弱。见图33.FPS-ZM1对小胶质细胞的氧化应激及抗氧化能力的影响本实验选用ROS、MDA水平评估AGEs对小胶质细胞产生氧化损害程度,AGEs-BSA(300 μ g/mL)作用小胶质细胞24h后,细胞内ROS、MDA均高于control组(P<0.01,P<0.01),与 AGEs-BSA 组相比,AGEs+F1 组、AGEs+F2 组、AGEs+F3组不同浓度的FPS-ZM1均能显著抑制ROS、MDA水平,差异有显著性(P<0.01,P<0.01)。不同浓度的FPS-ZM1干预各组ROS、MDA水平仍高于control组(P<0.05)。见图4,5选用SOD活性检测以及GSH含量测定,用以反应细胞内清除自由基的能力。AGEs-BSA(300 μ g/mL)作用小胶质细胞24h后,AGEs组细胞SOD活性较control组明显降低(P<0.01,P<0.01),与 AGEs-BSA 组相比,AGEs+F1 组、AGEs+F2 组、AGEs+F3组不同浓度的FPS-ZM1均能明显提高SOD活性水平(P<0.01,P<0.01),不同浓度的FPS-ZM1干预各组SOD活性仍低于BSA组(P<0.05)。AGEs组细胞GSH含量较BSA组明显降低(P<0.01),不同浓度的FPS-ZM1干预各组细胞GSH含量较AGEs组升高(P<0.05)。见图6,74.FPS-ZM1对小胶质细胞iNOS表达和NO含量的影响AGEs组处理小胶质细胞24h后,细胞产生NO含量明显高于control组(P<0.01),AGEs+F1 组、AGEs+F2 组、AGEs+F3 组各组 NO 水平低于 AGEs 组(P<0.01),差异有显著性(P<0.01,P<0.01)。采用 Western blot 检测细胞 iNOS表达,结果显示AGEs组的iNOS蛋白表达明显高于control组;与AGEs组相比,不同浓度FPS-ZM1干预后能明显抑制iNOS的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。见图85.FPS-ZM1减弱小胶质细胞AGEs诱导NADPH氧化酶(NOX)相关亚基单位的影响通过Western blot检测NADPH氧化酶的三个亚基单位NOX2、p47phox和p67phox,发现在原代小胶质细胞中,FPS-ZM1不仅能够减弱AGEs诱导小胶质细胞NOX2的生成,还能抑制p47phox和p67phox从胞膜到胞质的转运。见图96.FPS-ZM1提升原代小胶质细胞AGEs介导Nrf2-HO-1信号通路采用Western blot检测检测,结果显示AGEs组的细胞Nrf2、HO-1的蛋白表达明显低于Control组(P<0.01,P<0.01),与AGEs组相比,不同浓度FPS-ZM1干预后能明显提高Nrf2、HO-1的蛋白表达,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01)。提示FPS-ZM1能使AGEs介导细胞Nrf2-HO-1的信号通路上调,增加抗氧化能力。见图107.FPS-ZM1减弱AGEs激活原代小胶质细胞及降低磷酸化NF-κB-p65,TNF-α和IL-1 β的表达水平蛋白印迹法测定发现在原代小胶质细胞中,25 nM、50 nM、100 nM的FPS-ZM1能提升AGEs(AGEs-BSA 300μg/mL,30μL)诱导的细胞浆内磷酸化NF-κBp65的表达(P<0.01,P<0.01),抑制细胞核内磷酸化NF-κ Bp65的表达,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01),提示FPS-ZM1能抑制AGEs-RAGE激活核转录因子磷酸化NF-κBp65由细胞浆向细胞核内转移。见图11本实验结果显示AGEs组的细胞上清液中TNF-α,IL-1β的表达水平明显高于control组(P<0.01,P<0.01);不同浓度FPS-ZM1干预后能明显逆转AGEs诱导的二者产生含量,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。见图128.FPS-ZM1减弱原代小胶质细胞AGEs介导的COX-2/PGE2信号通路本实验结果显示AGEs组的COX-2和PGE2明显高于control组(P<0.01,P<0.01),与AGEs组相比,不同浓度FPS-ZM1干预后能明显抑制二者产生,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。见图139、检测结果显示,与AGEs组相比,NOX抑制剂API能明显抑制ROS生成,提示NOX是AGEs介导ROS产生主要酶类;iNOS抑制剂SMT+AGEs-BSA与单纯AGEs相比,NO含量明显降低,提示iNOS催化L-精氨酸是生成NO重要上游调节酶;Nrf2激动剂SFP明显提高了 AGEs诱导细胞内SOD的活力,能提高HO-1蛋白表达,提示Nrf2是抗氧化系统中重要上游调控因子;与AGEs组相比,ROS抑制剂NAC能明显提高AGEs诱导细胞胞浆内NF-κ B的表达,抑制细胞核内NF-κ B的表达,提示ROS是激活NF-κB促进炎性反应的重要上游介质。以上差异均有统计学意义(P<0.01)。见图15-18[结论]1.AGEs能够与RAGE结合上调小胶质细胞NADPH氧化酶及亚基NOX2的生成,促进p47phox和p67phox从胞膜到胞质的转运,促进ROS,增加MDA生成,启动氧化应激反应。同时,虽然Nrf2-HO-1通路受到AGEs介导代偿性升高,但因脂质过氧化反应破坏了与抗氧化能力相关的SOD活力和GSH生成,抗氧化作用受到限制。2.FPS-ZM1作为特异性RAGE受体阻断剂,能够阻断AGEs-RAGE通路,抑制NADPH氧化酶及相关亚基启动,进一步激活Nrf2-HO-1通路,提高抗氧化能力,有效抑制氧化产物生成。3.AGEs-RAGE能够激活小胶质细胞iNOS,促进NO大量生成,FPS-ZM1能够阻断AGEs-RAGE通路,抑制iNOS激活,减少NO的过量生成。4.AGEs可通过作用细胞表面的RAGE激活小胶质细胞,引发ROS大量生成,促进核转录因子NF-κ B向细胞核转化,激活NF-κ B促进大量炎症因子的表达,导致炎症反应,其通路为AGEs-RAGE-NADPH氧化酶-ROS-NF-κ B磷酸化,引发炎症。5.FPS-ZM1能从上游抑制AGEs-RAGE-NADPH氧化酶-ROS-NF-κ B磷酸化发生,减少细胞因子,减弱慢性炎症的发生。上述研究结果表明,FPS-ZM1通过直接阻断AGEs/RAGE相互作用,保护神经元免受AGEs诱导的RAGE依赖的氧化应激和炎症细胞损伤。这种多功能受体在AD治疗中有着非常广阔的应用前景。[研究意义]以上研究证实,AGE/RAGE信号转导通路能通过激活小胶质细胞NADPH氧化酶及亚基,引发氧化应激反应,抑制抗氧化系统,并能进一步激活核转录因子NF-κB,促进大量炎症因子释放,参与组织损伤。证明RAGE是AD治疗的有效靶点,研究新的小分子阻断RAGE作用的药物已成为必然趋势。FPS-ZM1是一种新型的小分子RAGE阻断剂,高效、低毒且易通过血脑屏障,研究结果表明,FPS-ZM1通过直接阻断AGEs/RAGE相互作用,保护神经元免受AGEs诱导的RAGE依赖的氧化应激和炎症细胞损伤,这种多功能受体在AD治疗中有着非常广阔的应用前景,FPS-ZM1是一种有潜力的AD防治药物。